SDS研究实验报告

SDS研究实验报告

　　一、研究背景及目的

　　对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。

　　要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。

　　但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。

　　新技术的发明常以原有技术作为基础。在活性电泳中，采用碱性体系，依靠浓缩效应实现了样品的浓缩，大大提高了分析的精度。而变性电泳属于全蛋白染色，结果较准确。在变性电泳中，要借助浓缩效应，就要使样品由负极向正极迁移，那么所选择的物质与蛋白结合之后要形成带负电的复合物。就这样，选择了十二烷基硫酸钠（SDS）作为变性剂。而且，发现形成的复合物成棒状，短轴恒定，而长轴与分子量相关。所以，SDS就成为了理想的变性剂。这种方法最适宜测定分子量是15,000—100,000的样品, 对低于10,000分子量的水解蛋白不太适用。通过改进，用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子量低于10，000的水解蛋白样品进行分子量测定。用这种方法测定蛋白质的分子量,分辨率高，所需设备廉价，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，因而其广泛应用于蛋白分离纯化和分子量测定。

　　因此，SDS-PAGE是目前常用的测定蛋白质分子量的方法。本实验通过利用SDS-PAGE测定实验四纯化的麦清蛋白，学习和掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理，掌握其具体操作；并与活性电泳进行对比，了解其异同，加深对电泳技术了理解。

　　二、实验原理

　　1、聚丙烯酰胺凝胶电泳可对蛋白质的种类和数量做定性分析，带电蛋白质分子在电场作用下将作定向移动,在其他条件( 电场、介质粘度等) 不变的情况下, 蛋白质在凝胶中的迁移速率受分子所带净电荷量与分子大小、形状等因素的影响。如果两种不同分子量的蛋白质的分子大小的差异被所带净电荷量的差异所补偿时,则这两种不同分子量的蛋白质可以相同的速率电泳,无法通过电泳距离测定蛋白质的分子量。因而要测定分子量则需要蛋白质以分子量为唯一变量进行泳动，即需要引入某种物质与蛋白结合消除净电荷和分子形状的影响。

　　由于变性电泳由活性电泳发展而来，浓缩效应是在碱性体系下建立的，在此体系下蛋白质带负电，又由于蛋白质的等电点普遍低于7，在碱性体系下不同蛋白质所带电荷量不同，自身差异更大，分离效果更好。因而要引入的这一能消除蛋白质自身所带净电荷的物质在电泳体系下应带负电荷。另一方面，我们要引入的物质应能与蛋白质普遍稳定地定量结合，结合后不同分子量的多肽链形状类似，使各多肽链间的差别集中在分子量上。

　　通过试验与实践，人们找到了一种双亲性物质即SDS，SDS是十二烷基硫酸钠的简称，是一种很强的阴离子表面活性剂，SDS以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS的结合，所引入的净电荷大约为蛋白质本身净电荷的10倍，使SDS-蛋白质复合物所带电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。在分子形状方面，SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，在18A数量级，与蛋白质种类无关，棒的长轴是变化的，其变化正比于蛋白质分子量。说明SDS和蛋白质结合所形成的SDS-蛋白质复合物消除了由天然蛋白质形状的不同而对电泳迁移率的影响。

　　2、在SDS的存在下，蛋白质在电场中泳动时其迁移率仅与蛋白质分子质量有关。二者的关系式为：lgM=ab

　　其中，M为相对分子质量，Rm为相对迁移率——蛋白质在凝胶中的迁移距离与指示剂前沿距离的比值，a、b为常数。从上式可知，蛋白质分子质量的对数与蛋白质迁移率呈线性负相关。在同一块电泳凝胶上对一组已知分子量的标准蛋白质和蛋白样品分别进行SDS-PAGE分析，以标准蛋白的迁移率为横坐标，以分子质量的对数为纵坐标绘制标准曲线，从未知蛋白质的迁移率即可求出蛋白质亚基的分子质量。

　　三、仪器与试剂

　　实验材料：实验四麦清蛋白脱盐样品

　　实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）；丙烯酰胺（Acr）；甲叉双丙烯酰胺（Bis）；十二烷基硫酸（SDS）；N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；甘油；巯基乙醇；异丙醇；溴酚蓝；考马斯亮蓝R-250；甘氨酸；盐酸；乙酸；冰乙酸。

　　实验仪器：直流稳压电源（600V，100mA）；移液器；烧杯（50ml×2）；实验仪器：DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYY-III2电泳槽（北京市六一仪器厂）；微量进样器50μl（上海安亭微量进样器厂）；大培养皿一套。

　　试剂配制：

　　实验仪器：DYY-III2稳压稳流电泳仪一套（北京市六一仪器厂）、烧杯50ml×3，微量进样器（上海安亭微量进样器厂）、大培养皿一套、微量可调手动移液器（大龙）。

　　四、实验方法

　　1、贮液配制（教师完成）

　　按照实验指导43页配制贮液，注意：配好的丙胶贮液盛于棕色瓶中置冰箱中保存，可放1~2个月；过硫酸铵和染色液应当天配制；电极缓冲液用时稀释10倍；如有不容物应当过滤。

　　2、凝胶的制备

　　（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。

　　（2）安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片。

　　（3）用2%琼脂封底，以防漏胶。

　　（4）按下表所示配制分离胶

　　在小烧杯中混匀后，立即灌胶。灌胶时，将电泳槽稍倾斜，用手扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端，小心将溶胶倒入两玻璃片之间，灌至据短玻璃片顶端2cm左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖2~3mm的水层。灌注水层是要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可以看出界面，后逐渐消失；等到再出现界面时，表明分离胶已经聚合，再静置一会儿，将水倒出，用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，准备灌注浓缩胶。

　　（5）按下表配制浓缩胶

　　混匀后立即灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲液没过电极丝，然后小心拔出梳子，准备点样。

　　3、样品的处理

　　Marker：市售标准样品按要求制备。

　　待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管制备的SDS-PAGE样品。 所有样品于沸水浴中加热5min，冷却后上样。

　　上样量：Marker 20μl，待测样品4μl、10μl、20μl、30μl、50μl。

　　4、电泳

　　接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）。打开电源开关，调节电流，初始时控制在15mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到25mA左右。实验中溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢。

　　5、检测

　　电泳结束后，取出胶板，现在水中浸泡10min，以浸出部分SDS，然后把胶板转到染色液中过夜，将蛋白质固定并染色（或加热2h，在通风橱中操作）。然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。

　　6、测定蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量

　　用卡尺或坐标精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，记溴酚蓝迁移的距离为d1，蛋白质迁移的距离为d2，根据下面的公式计算出各种蛋白质的迁移率Rm：Rm=d2/d1。

　　以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数值为纵坐标作图。然后给句待测样品的迁移率，在图上查出其对应的分子量。并由所得结果分析实验四麦清蛋白初步提取的实验效果以及后续进一步分离纯化的方案。

　　五、数据整理及结果计算与讨论及分析

　　（一）结果计算与分析

　　以marker蛋白的迁移率Rm为横坐标，对应蛋白分子量的对数为纵坐标，做出本次实验的SDS-PAGE分子质量测定标准曲线。

　　有上可得，标准曲线的方程为y = -1.1355x + 5.0731。其R2 = 0.9639，曲线可用。将麦清蛋白的相对迁移率0.2287带入曲线方程，得到其分子量的对数为4.8134，则其分子量为65072Da，约为65.1kDa。

　　（二）讨论

　　本次实验与上次的活性电泳不同，除了跑在最前面的溴酚蓝前沿，还有一个蛋白前沿。蛋白前沿的产生是因为在实验中有些蛋白降解为较短的小肽段，分子量仅比溴酚蓝大一些，迁移速度超出了其他蛋白，且在胶板中发生侧向扩散，形成蛋白前沿。同时，靠近蛋白前沿的部分有大量分子量较小的蛋白样品聚集，它们并非我们需要 品，因为分离胶不够长而没有分开。

　　本次实验我组顺利的将marker的七条带均匀跑开并显现出来，说明这次实验中我组在操作上基本无大的问题。对于最后一条marker带出现上翘情况，经与老师分析讨论后，认为对于偏向下部的条带尤其是靠近底部的条带，会受到胶板边缘效应的影响，会发生偏折。因此在今后的实验操作中，对于这种情况，应避免使用此处的marker进行计算。

　　我们指定了靠近Marker第二条带的一条颜色很深的条带作为目标蛋白，这是因为这一蛋白含量相对较高，与其他蛋白明显分离开来。通过上面的计算，得到这种蛋白的相对分子质量为65.1kDa。

　　在对Marker进行作图的时候，我们发现116.0kDa的条带并不在直线上，其迁移的距离明显超过了应有的迁移距离，说明在电泳过程中这个蛋白迁移速度过快。考虑到其他条带的迁移正常，我们认为可能的原因有两个：一是Marker本身的质量问题，标称116.0kDa的蛋白分子量不足116.0kDa；二是凝胶组成的问题。实验中所用的凝胶孔径过大，导致凝胶对分子量最大的标准蛋白的阻碍作用不足，使这个蛋白迁移速度超出了本来应有的速度。

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