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枸杞多糖对大鼠腰椎间盘退变影响的形态学
枸杞多糖对大鼠腰椎间盘退变影响的形态学
【摘要】 目的 探讨枸杞多糖(LBP)对大鼠退变腰椎间盘的形态学的影响。
方法 将健康雄性SD大鼠42只，随机分为假手术组、椎间盘退变组、LBP干预组，每组14只。
采用手术方法制作大鼠腰椎间盘退变模型，LBP干预组在造模后4周，每天上午8：00灌胃给药，80mg?mL-1，容量为1mL?kg-1，连续4周。
假手术组及椎间盘退变组分别给予等容量生理盐水灌胃，连续4周。
在造模后8周三组所有大鼠再次麻醉，取出椎间盘组织，分别在光镜及电镜下观察椎间盘形态学的变化。
结果 HE染色光镜观察假手术组髓核细胞丰富，形态不规则，集中成簇;椎间盘退变组髓核细胞稀少，细胞基质见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞有变性、坏死，但较椎间盘退变组退变程度减轻。
电镜下假手术组的髓核细胞多见，核膜完整，细胞器丰富;椎间盘退变组髓核细胞减少，细胞器缺失，见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞减少，有变性、坏死，退变较椎间盘退变组减轻。
结论 LBP可能对大鼠腰椎间盘髓核组织退变有延缓作用。
【关键词】 腰椎间盘;退变;枸杞多糖
腰椎间盘退行性变(Intervertebral Disc Degeneration，IVDD)是导致下腰痛和神经痛的主要原因[1-2]。
椎间盘退变是个复杂的病理过程，引起退变的确切原因尚不清楚。
目前研究的关注点在于如何寻找有效的药物或生物制剂抑制细胞因子或炎症介质，从而延缓或抑制椎间盘退变的发生、发展。
实验证实[3-4]椎间盘退变表现为一系列组织形态学上的变化。
观察用药后椎间盘组织形态学的变化，可验证药物或生物制剂对椎间盘组织的作用。
本实验采用枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)作为干预剂作用于腰椎间盘组织退变的大鼠，并通过组织形态学的观察以验证其对椎间盘退变组织的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选取雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠42只，购于宁夏医科大学实验动物中心，体重400～476g，动物合格证号：SCXK(宁)2005-0001。
1.2 药品及试剂
LBP溶液(宁夏启元药业公司生产的粉剂，批号：GF03002-l，纯度58.56%)，使用前用生理盐水配制80mg?mL-1新鲜溶液。
1.3 方法
1.3.1 实验动物分组
随机将大鼠分为假手术组(14只)、椎间盘退变组(14只)和LBP药物干预组(14只)。
1.3.2 大鼠腰椎间盘退变造模
采用陈德胜等[5]建立大鼠腰椎间盘退变模型的方法，以6.5%的水合氯醛(购于宁夏医科大学总医院制剂中心)0.055mL?kg-1腹腔注射麻醉SD大鼠无菌条件下沿腰背部棘突做后正中切口，切开皮肤后，沿骨膜下剥离，充分显露L1～6棘突、关节突及椎板。
咬骨钳去除棘突、关节突、棘上、棘间韧带，切断双侧竖棘肌，依层缝合皮下筋膜、皮肤。
假手术组SD大鼠仅切开皮肤后即缝合。
1.3.3 LBP药物干预方法
LBP药物干预组在造模后4周，每天上午8：00灌胃给药，容量为1mL?kg-1，连续4周。
假手术组及椎间盘退变组分别灌胃给予等容量生理盐水，连续4周。
在大鼠腰椎间盘退变模型建立8周后三组所有大鼠再次麻醉，显露腰椎间盘，迅速取出L3～4或L4～5椎间盘组织。
1.4 光学显微镜下观察
三组大鼠椎间盘组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，脱水、石蜡包埋、组织切片(厚4～5μm)，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察椎间盘髓核组织的形态学变化。
1.5 电子显微镜下观察
迅速将切除的椎间盘组织先置于2%戊二醛溶液固定，2 h后，待髓核的蛋白组织彻底变性、凝固后再切取髓核组织，0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，每次间隔2 h之后固定过夜。
1%锇酸固定，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂812包埋，超薄切片经柠檬酸铅染色后，在日立H-600型透射式电子显微镜下观察并摄片。
2 结果
2.1 光学显微镜下观察结果
2.1.1 假手术组
可见较多的髓核细胞和不定型的基质，细胞形态不规则集中成簇，细胞质染色深，细胞外的基质丰富，细胞周围含水量较明显，胶原纤维排列整齐，见图1-A(封2)。
2.1.2 椎间盘退变组
髓核细胞数目减少，细胞内出现空泡，细胞周围基质较多，细胞含水量减少，同时出现大量的空泡，胶原纤维环排列紊乱，见图1-B(封2)。
2.1.3 LBP药物干预组
髓核细胞出现不同程度的数目减少和形态变化，髓核细胞有变形、坏死 ，见图1-C(封2)。
与椎间盘退变组相比，髓核细胞数目及细胞外基质较多，空泡数目较少。
2.2 电子显微镜下观察结果
2.2.1 假手术组
髓核细胞有突起，细胞核多呈卵圆形或圆形，核膜完整，染色体位于细胞核中央。
细胞质内粗面内质网多并排列整齐，可见生长良好的线粒体和高尔基体，细胞浆内有大量的糖原颗粒，见图2-A(封2)。
2.2.2 椎间盘退变组
可见坏死的髓核细胞，死亡的细胞外周出现增厚的组织，密度较高。
少见的髓核细胞出现空泡变性，核内染色质凝集，核膜不完整，细胞质内细胞器稀少。
粗面内质网、高尔基体空泡状，线粒体肿胀、崩裂或空泡化。
严重者细胞器分辨不清，胞浆基质密度加深、整个细胞体积缩小。
有的细胞呈凋亡改变，胞质模糊不清，胞膜不完整或缺如。
细胞质内被大量的空泡填充，见图2-B(封2)，部分细胞出现不同程度的凋亡改变。
2.2.3 LBP药物干预组
髓核细胞可见突起和皱褶，体积虽有缩小但大于造模组，细胞核有变形，染色质出现排列异常，但形态较规则。
细胞器依稀可见，有的模糊不清，胞膜欠完整。
有的可见细胞质内的线粒体，但线粒体内嵴样结构观察欠清晰。
细胞质电子密度低的空泡明显少于椎间盘退变组，见图2-C(封2)。
3 讨论
随着我国老龄化社会的到来，机体退变性的病变如椎间盘退变引起的脊柱疾患日益构成对人民健康的威胁，并严重影响其生活质量。
采取有效的药物或生物制剂延缓或抑制椎间盘退变的发生、发展一直是近年来脊柱外科研究的热点。
椎间盘髓核细胞及纤维环在维持内环境稳定性及修复椎间盘退变的过程中起着至关重要的作用[6]。
本实验的大鼠椎间盘退变模型是通过改变脊柱生物力学，使得椎间盘稳定性失衡，从而椎间盘出现退行性改变。
椎间盘的组织形态学改变与椎间盘退变发生、发展密切相关。
实验证实：椎间盘退变表现为一系列组织形态学上的变化[3-4]。
光学显微镜下观察，正常的椎间盘组织可见髓核细胞分布在髓核中，细胞增殖活跃，胶原纤维排列整齐。
随着年龄的增长发生渐进性的退行性改变，表现为细胞减少，组织结构紊乱的程度逐渐加重，胶原纤维增生、粗大、走行紊乱[7]。
本实验研究的假手术组、可见较多的髓核细胞和不定型的基质，细胞形态不规则集中成簇，细胞外的基质丰富，胶原纤维排列整齐。
而椎间盘退变组与上述正常椎间盘组织形态和椎间盘自然退变的形态学变化相符合。
LBP药物干预组为髓核细胞出现不同程度的数目减少和形态变化，髓核细胞有变形、坏死。
此组光学显微镜下的病理改变介于上二组之间，说明LBP可能对椎间盘退变有延缓作用。
从根本上而言，退变椎间盘的变化在于自身细胞的功能退化、凋亡和坏死。
通过超微结构的观察，以明确椎间盘退变发生、发展的相关程度。
正常的椎间盘组织超微结构表现为髓核细胞胞膜外有突起，核膜完整，染色体位于细胞核中央。
细胞质的细胞器表现为大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些多聚核糖体和单个核糖体。
线粒体数量多，呈板状或管状嵴。
胶原纤维在正常间盘排列紧密，呈波浪状。
而发生退变的椎间盘会出现相应的变化。
刘勇等[8]电镜下观察突出椎间盘组织，发现细胞胞质中的线粒体数量少或看不清，粗面内质网减少，严重退变细胞中溶酶体、空泡和微丝增多，坏死细胞中细胞器空化。
这些都是细胞功能衰退的征象，并与退变的程度相关。
Helen等[9]电镜下观察不同年龄阶段椎间盘胶原纤维的波纹发现，胶原纤维在正常间盘排列紧密，呈波浪状，而在退变间盘中排列稀疏和折皱。
本实验电子显微镜下观察结果与上述文献报道比较吻合，证实了通过手术方法建立的大鼠腰椎间盘退变模型[5]椎间盘超微结构的改变与椎间盘退变程度相关。
LBP药物干预组为髓核细胞出现不同程度的数目减少和形态变化，髓核细胞有变形、坏死。
此组超微结构的病理改变介于假手术组和椎间盘退变组之间，进一步验证了LBP可能具有延缓椎间盘退变的作用。
本文通过光镜和电镜观察了LBP对大鼠退变的椎间盘髓核组织形态学的影响，验证了LBP可能有延缓或抑制椎间盘退变的作用，为寻找预防、治疗椎间盘退变的药物提供了实验依据。
【参考文献】
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[3] Ergün T，Lakadamyal H，Sahin MS.The relation between sagittal morphology of the lumbosacral spine and the degree of lumbar intervertebral disc degeneration[J].Acta Orthop Traumatol Turc,2010,44(4)：293-299.
[4] Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain[J].Rheumatology (Oxford),2009,48(1)：5-10.
[5] 陈德胜，金群华，李燕，等.一种大鼠腰椎间盘退变模型的建立[J].中华实验外科杂志，2006,23(4)：625-626.
[6] 王锋，王运涛，吴小涛.髓核细胞修复椎间盘退行性变的研究进展[J].中围修复重建外科杂志，2009,23(7)：864-867.
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[8] 刘勇，胡有谷，陈晓亮.不同病理类型椎间盘突出组织的超微结构观察[J].中国脊柱脊髓杂志，2003,13(7)：416-418.
[9] Helen EG，Edward NH.Observations on morphologic changes in the aging and degenerating human disc[ J]. BMC Musculoskelet[J].Disord,2002,3(1)：9.
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