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聚酰胺分离纯化薇菜黄酮
聚酰胺分离纯化薇菜黄酮
摘要：以薇菜为原料提取黄酮类化合物，以上样量、洗脱流速、乙醇浓度为考察对象，采用聚酰胺柱层析法优化分离纯化工艺条件。
结果表明：最佳分离工艺参数为上样量3mL(浓度0.749mg/mL)、70%的乙醇、200mL/h的流速洗脱，谱峰较窄，洗脱峰的黄酮含量达到14.45%。
此法可较好地分离纯化薇菜黄酮类化合物，经济实用。
关键词：薇菜;黄酮;聚酰胺树脂;分离纯化
薇菜属蕨类植物门(Pterdophta)、紫萁属(Osmunda)多年生蕨类植物。
以初生嫩叶干制后食用，具有很高的营养价值和经济价值，含有丰富的蛋白质、多糖、黄酮、脂肪、纤维素、矿质元素等营养物质，深受消费者青睐。
薇菜富含黄酮类化合物，据研究，黄酮类化合物有抗癌、抗衰老、治疗骨病和骨质疏松等功效，具有提高记忆力、抗过敏、活血化瘀、利胆及肝脏保护作用H。
麦叶中提取的黄酮类化合物对超氧阴离子自由基(02・)、羟基自由基(・OH)有清除作用，能抗氧化。
目前，关于薇菜黄酮类化合物的分离纯化工艺学研究方面的报道少见，尚不成熟。
本研究采取超声波萃取法，对薇菜中黄酮类化合物进行提取工艺及用聚酰胺树脂分离纯化工艺的研究，寻求最佳的提取分离纯化条件，以推进植物资源的有效开发利用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料。
薇菜采回后洗净，置于105%烤箱中烘烤0.5h，然后置于90%烤箱中烘干，粉碎后过80目筛，备用。
1.1.2仪器设备。
日本岛津公司生产的UV一2550型分光光度计;日本Hitachi公司生产的CR一21G型离心机;上海锦屏仪器仪表有限公司生产的数显水浴锅;宁波新芝生物科技股份有限公司生产的超声波;广州仪科实验技术有限公司生产的磁力搅拌器;上海泸西分析仪器厂有限公司生产的2.6cm×20cm层析柱;上海泸西分析仪器厂有限公司生产的HL-2恒流泵;上海泸西分析仪器厂有限公司生产的Bs-100A自动收集器。
2.2方法
2.2.1黄酮含量的测定。
按照九里香总黄酮提取工艺的方法进行，得回归方程为：y=0.7083x-0.0065(R2=0.9997)。
将提取的黄酮粗液按照标准曲线的操作方法测定其吸光度，利用回归方程即可计算黄酮的含量。
2.2.2样品脱色处理。
称取适量薇菜粉末，置于500mL烧杯中，加石油醚进行脱色处理。
在常温下，使用磁力搅拌器不断搅拌，重复3次，每次5h，抽滤、捣碎，放在90%烤箱中烘干备用。
2.2.3薇菜粗黄酮提取分离。
薇菜粗黄酮提取分离参照薇菜叶总黄酮提取工艺条件优化的方法进行。
2.2.4薇菜粗黄酮的分离纯化。
(1)聚酰胺树脂的预处理。
称取600g聚酰胺粉末于1L的烧杯中，倒入95%的新鲜乙醇煮沸0.5h，然后离心甩干，倒入新鲜乙醇煮沸，重复3次即可上柱。
(2)聚酰胺的纯化方法。
称取45g备用聚酰胺树脂，湿法装入内径为2.6cm×20cm的层析柱中，静置30min，用5BV超纯水洗脱水溶性小分子物质。
室温下，取不同上样量的提取液以不同的流速通过树脂，再用不同浓度的乙醇溶液洗脱，测定其洗脱液的黄酮含量，从而考察上样量、洗脱流速、洗脱乙醇浓度等因素对薇菜黄酮洗脱率的影响。
(3)洗脱液黄酮检验。
将收集的洗脱液，每管取2mL于试管中，测定黄酮含量，并计算洗脱峰的洗脱率。
3结果与分析
3.1上样量对薇菜黄酮洗脱率的影响
分别取1mL、2mL、3mL、4mL黄酮提取液上样，控制洗脱液流速200mL/h，5BV超纯水洗脱，然后用70%乙醇溶液洗脱收集。
图1～4可知，随着上样量的增加，最大的洗脱率分别为5.45%、9.73%、14.45%、17.13%，均出现在5～8管之间。
3.2洗脱流速对薇菜黄酮洗脱率的影响
取3mL(浓度为0.749mg/mL)黄酮提取液上样，分别控制100、200、300、400 mL/h洗脱液流速，5BV超纯水洗脱，然后用70%乙醇溶液洗脱收集。
图5～8可知，随着洗脱流速依次减小，洗脱峰时黄酮含量分别为9.03%、8.50%、14.45%、8.93%。
洗脱液的流速影响层析的分离效果，速度慢会造成分离时间长，谱峰变宽、流速快。
洗脱速度通常要保持恒定，根据实际情况，流速为200mL/h适宜薇菜黄酮类化合物的分离。
3.3乙醇浓度对薇菜黄酮洗脱率的影响
取3mL(浓度为0.749mg/mL)黄酮提取液上样，分别用30%、50%、70%、90%的乙醇洗脱，洗脱流速控制200mUh洗脱液流速，5BV超纯水洗脱，然后用70%乙醇溶液洗脱收集。
试验表明，从图9～11看出，用50%、70%、90%的乙醇洗脱，黄酮类化合物的洗脱率分别为5.67%、14.45%、7.37%，随着乙醇浓度的增大，黄酮的洗脱率先增加后减小。
4讨论
聚酰胺柱层析法纯化薇菜黄酮提取液的最佳工艺参数为上样量为3mL(浓度为0.749mg/mL)、控制流速200mL/h、乙醇洗脱浓度为70%、洗脱率为14.45%。
选择上样量是提高洗脱率和直接影响黄酮纯化的重要因素，当上样量较大时，在柱子中形成1条较宽的洗脱带。
在流速和洗脱浓度一定的条件下，洗脱带过宽不利于高纯度黄酮的形成。
当上样量刚好在柱子中形成薄薄的一层，便于洗脱，上样量过大，聚酰胺吸附带宽，洗脱时拖尾现象严重。
因此，选择上样量为3mL(浓度为0.749mg/mL)较适合薇菜黄酮分离纯化，控制洗脱流速可以提高分离纯化薇菜黄酮。
乙醇浓度是洗脱薇菜黄酮类化合物的关键，由于薇菜中黄酮类化合物的溶解度不同，在分离洗脱过程中，70%乙醇洗脱效果最佳。
每个处理收集的洗脱液，第5～10管黄酮含量相对于其它管高很多，证明薇菜中主要含有的黄酮类化合物成分集中在这一区域。
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