博士研究生学位论文开题报告

时间：2020-11-08 18:09:03 开题报告我要投稿

博士研究生学位论文开题报告

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博士研究生学位论文开题报告

　　论文题目：TGF-β1对白血病细胞的作用研究及其机制初探

　　一、立题依据

　　转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF- β)是一种多功能细胞因子，因其能使正常成纤维细胞的表型发生转化而得名。它有五种异构体：TGF-β1 TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4、 TGF-β5，其中TGF-β1作用最强，目前的研究也主要针对TGF-β1。TGF-β1是迄今为止了解的功能最复杂的细胞因子之一，是一种具有多种生物学功能的生长因子,目前已知的功能主要有调节细胞生长和分化，诱导细胞凋亡,影响细胞粘连和细胞迁移，促进细胞外基质的形成,调节胚胎发育过程,促进创伤愈合，参与对免疫抑制以及炎症反应的调节等，TGF-β1还是促进肝脏纤维化的重要细胞因子。TGF-β1 对不同的靶细胞也表现出不同的生物学活性，TGF -β受体广泛表达于机体组织细胞,由于体内大部分的正常细胞均表达TGF -β家族成员的膜结合受体, TGF-β1与其受体具有高度特异的亲和力,因此, TGF-β1对许多细胞都发挥调节作用;生长抑制是TGF-β1特有的性质, TGF-β1对大多数细胞的增值具有抑制作用,尤其是上皮细胞、内皮细胞、淋巴样细胞或造血细胞。

　　TGF-β1与肿瘤的发生、发展密切相关,在肿瘤发生早期, TGF-β1 作为肿瘤抑制因子起作用, TGF-β1对正常细胞及早期肿瘤的抑制作用是通过调控细胞周期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡来实现的，通过抑制细胞生长周期从G1 →S 期抑制正常细胞生长和肿瘤细胞发生。在G1 期早期, TGF-β1诱导的抑制信号作用于原癌基因c-myc ,抑制肿瘤的形成; 在G1期晚期, TGF-β1通过抑制细胞周期蛋白(cyclins) , 通过增加周期循环蛋白依赖性激酶(CDKs)的抑制性蛋白p15 、p21 、p27 的生成,抑制CDKs的活性,使细胞停止在G1 期或延长G1 期,进而抑制细胞增殖, 诱导细胞分化或凋亡。如果TGF-β1信号通路中多种基因突变导致细胞对TGF-β1耐受而使衰老和凋亡通路失活,则可能发生细胞癌变。c-myc蛋白是细胞增殖的重要的调节因子,表达c-myc的细胞能迅速通过G1 期进入S 期,而 TGF-β1可迅速下调c-myc 的mRNA 及蛋白水平。近年来,围绕TGF-β1诱导凋亡的分子机制进行了大量的基础研究。研究表明:在许多类型细胞中, TGF-β1家族成员不仅能抑制细胞增殖且诱导细胞凋亡,由Smad 转录复合物控制的前凋亡基因在TGF-β1诱导细胞凋亡的过程中起重要作用。在造血细胞中, TGF-β1诱导的凋亡依赖于依赖Smad 的SHIP 表达的上调并通过生存蛋白激酶AKT抑制信号系统。

　　TGF-β1作为一种重要的肿瘤抑制因子,在血液系统疾病的发生中起重要作用，我们已在这方面开展了若干研究中。我们前期研究中曾用ELISA法检测急性白血病患者血清及急性白血病原代细胞和细胞株培养上清TGF-β1 水平变化，研究发现急性白血病患者血清中TGF-β1水平明显减低，经治疗获缓解后其水平恢复正常，复发患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代细胞和细胞株培养上清TGF-β1水平与正常细胞相比有明显下降。应用 RT-PCR 方法检测正常巨核细胞、血小板、外周血有核细胞及8种细胞株包括有HEL、K562 、HL60 、U937 、DAMI、MEG-01 、HUT78、CA的TGF-β1　mRNA，结果显示这些细胞均能表达TGF-β1，这说明在白血病患者血清及急性白血病原代细胞和细胞株培养上清中TGF-β1的低水平很可能与TGF-β1自身产生过程下游蛋白的生成、包装、分泌受破坏有关，这也提示TGF-β1的低表达可能在急性白血病发病机制中起重要作用。

　　TGF-β1对红系、粒系、巨核系晚期祖细胞的分化均具有刺激作用，TGF-β1还有诱导粒系、淋巴系白血病细胞的凋亡作用，我们的研究发现全反式维甲酸诱导HL-60细胞分化成熟的过程中，内源性TGF-β1 mRNA表达上调，我们的研究也发现加入外源性猪全长TGF-β1基因可抑制白血病细胞增殖，诱导白血病细胞凋亡;另一实验中，将DAMI细胞与TGF-β1孵育48小时后不仅其生长增殖受抑且有呈现细胞凋亡;而在用 AS2O3诱导 HL-60 细胞凋亡的过程中TGF-β1 表达水平增高，bcl-2 基因表达减弱，在此过程中，细胞分泌TGF-β1水平有明显增高，加入TGF-β1反义ODNS 能够部分抑制 AS2O3诱导的细胞凋亡，bcl-2 基因表达有所恢复，提示在AS2O3诱导的 HL-60细胞凋亡过程中内源性 TGF-β1 起着重要作用，可能是促进血细胞凋亡的内在动力之一。同时我们还利用真核表达载体将外源性野生型p53基因(wt-p53)导入无p53蛋白表达的 HL-60、K562 细胞中，在 wt-p53 基因诱导 HL-60、K562 细胞凋亡早期内源性 TGF-β1mRNA 表达上调，且细胞分泌 TGF-β1 的水平有明显提高，TGFβ1 的反义 ODNS 能够部分抑制 wt-p53 诱导的细胞凋亡,使 wt-p53 所致的 K562 细胞 bcl-2 表达阳性率恢复到未经 wt-p53 处理前的'水平，提示 wt-p53 基因在诱导白血病凋亡过程中内源性TGF-β1发挥一定作用，内源性 TGF-β1与 bcl-2 表达之间存在密切关系。

　　由于TGF-β1有如此复杂的功能，对不同的靶细胞也表现出不同的生物学活性，我们设想通过外源诱导物准确定量调控TGF-β1表达，若能调控成功必将能为我们下一步研究TGF-β1与肿瘤关系提供更多帮助。

　　迄今为止，己发展多种可诱导基因表达系统，但各自都有局限性，多数可诱导基因表达以重金属离子和激素作为诱导剂，诱导表达水平难以准确调控，诱导刺激可引发多种效应，且在诱导剂存在时，时常出现表达渗漏的现象，这些不足限制这些可诱导基因表达系统的应用;而基于LiAC阻遏因子的IPTG诱导表达系统中，尽管其作用较为特异，但诱导过程缓慢，诱导效率低，且诱导剂量接近细胞毒水平，目前应用最为广泛的是四环素调控基因表达系统(Tetracycline-regulated gene expressionsystem)，是由Gossen等人首先建立的。Tet 调控系统主要包括两部分: 特异启动子控制下的Tc 依赖的反式作用子(tTA ) 及tTA 依赖的核心微小启动子(人巨细胞病毒启动子PhCMV) 调控下的目的基因，前者是由大肠杆菌的tetR 和人类单纯疱疹病毒(HSV ) 的病毒蛋白P16 (V P16) 的C2末端具有转录激活作用的区域构成的融合蛋白, 其中TetR 介导tTA 与TetO 的结合,V P16 则具有转录激活作用; 后者是在PhCMV 的上游插入7 个头尾相连的TetO 序列, PhCMV 本身启动转录的能力很低, 但tTA 与TetO 结合后即可激活目的基因高水平地表达, 而Tc可抑制tTA 与TetO 的结合, 从而抑制转录，由于Tc的应用阻抑了目的基因的表达, 故将该系统称为Tet-off 系统。

　　1995年，Gossen等基于Tet-off系统，通过随机突变改变四环素阻遏蛋白(TetR )上4个氨基酸，使其分子结构发生变化，建立了Tet-on基因诱导表达系统，该系统受四环素及其衍生物强力霉素作用刚好与Tet-of系统相反，即在没有四环素及其衍生物强力霉素的情况下，表达水平几乎为零，而在加入四环素及其衍生物强力霉素后目的基因高效表达。在Tet-off系统里，如果需关闭外源基因的表达，就需一直维持诱导物的存在，而Tet - on系统为激活型表达系统，需要外源基因表达时才加诱导物，相比之下，Tet一on系统具有快速激活基因，诱导动力学受体内Tet的影响相对较小，能更精确的进行目的基因的调控，使用更为方便经济。所以，Tet - on系统已被成功的应用于哺乳动物细胞培养、转基因鼠、基因治疗研究

　　T-REx系统是一种用于哺乳动物的四环素调控基因表达系统，其调控元件来自大肠杆菌E. coli Tn10编码的四环素耐药操纵子。在该系统中，四环素对目标基因的调控有赖于外源性四环素与质粒中TetR结合，从而使控制目的基因表达的启动子去阻遏，T-REx系统中最重要的构成成分是可诱导表达质粒---pcDNA4/TO/myc-h i s A, B, C。目的基因在该质粒CMV启动子的调控下得以表达。该质粒的CMV启动子中含有两个四环素操纵子序列( Tet0 )，每个四环素操纵子含有19个核苷酸(5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')序列。两个四环素操纵子序列被2个硷基对的空间所隔开。每个19个核苷酸序列做为一个TetR同源二聚体的结合位点。T-Rex中新近发展的Tet-off/Tet-on系统是一种高效无毒、具有严密开/关功能的基因诱导表达系统，具有严密性、特异性、高效性等优点，该系统是目前比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一。

　　应用T-REx调控系统对导入外源性TGF-β1基因进行白血病细胞内源性TGF-β1定量表达调控，以及定量调控后对白血病细胞生物学特性影响的研究目前国内外均未见报道，本课题的研究旨在进一步深入探讨TGF-β1对白血病的作用及机制。

　　二、　研究目的、意义和应用前景

　　以白血病细胞HL-60为模型，人全长TGF-β1基因为对象，研究TGF-β1对白血病细胞体外和体内作用的同时，利用四环素调控系统,构建可调控的含人全长TGF-β1基因真核表达载体，用脂质体转染法将人TGF-β1基因转染HL-60细胞中，研究TGF-β1基因转染后HL-60细胞的TGF-β1表达的定量调控，及转染基因细胞的生物学特性改变，观察转染基因细胞的体内致瘤性，进一步探讨TGF-β1对白血病的作用及机制。

　　三、课题设计方案及技术路线

　　(一)研究TGF-β1对HL-60细胞体内外抗白血病的作用。

　　(二)　pcDNA4- TGF-β1 质粒构建。

　　通过酶切→去磷酸化→连接→转化→单克隆菌落培养扩增→大量抽提，构建并提取构建好的pcDNA4- TGF-β1 质粒，经PCR鉴定、酶切电泳鉴定、及最终DNA测序，选出全长TGF-β1片段正向连入pcDNA4/TO的质粒。

　　(三) pcDAN6/TR质粒转染HL-60细胞并筛选，单克隆扩大培养。

　　1、确定Blasticidin 的筛选浓度。

　　2、脂质体法转染HL-60细胞，通过Blasticidin筛选，获得稳定转染细胞命名TREx- HL-60细胞。

　　(四)将构建的pcDNA4- TGF-β1 质粒转染 TREx- HL-60细胞,并筛选，单克隆扩大培养。

　　1、确定Zeocin的筛选浓度。

　　2、脂质体法转染 TREx- HL-60细胞,通过Zeocin筛选，获得稳定转染细胞命名HL-60-PTT细胞。

　　(五) 对HL-60-PTT细胞进行生物学特性研究。

　　1、用ELISA法、 Western blot方法测定不同浓度四环素作用下HL-60-PTT细胞的TGF-β1 的表达水平。