恶性疟原虫PfRNaseⅡ的克隆表达与降解特性的性状分析论文

时间：2022-10-09 11:27:28 论文范文我要投稿

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　　在真核生物中，DNA转录生成RNA，然而其中只有极少部分的RNA 编码蛋白质，大部分基因组序列转录生成非编码RNA (ncRNA)。ncRNA根据其功能的不同可分为持家ncRNA和调节ncRNA，其中调节ncRNA曾被认为是转录“噪音”。随着测序技术的发展，越来越多的研究表明ncRNA可在转录、转录后以及表观遗传等水平来调控基因的表达，从而参与机体的生长发育、疾病发生以及病原体毒力相关基因的表达等过程。尽管RNA 在生物体中发挥重要作用，然而RNA的新陈代谢离不开核糖核酸酶特别是核糖核酸外切酶的参与。研究表明核糖核酸外切酶与病原体的毒力表型有关，其机制尚不清楚，可能与核糖核酸外切酶参与RNA的加工、降解、稳定等过程有直接或间接的联系。恶性疟原虫是疟疾的主要病原体之一，致病力强，致死率高，对人类的危害严重。

恶性疟原虫PfRNaseⅡ的克隆表达与降解特性的性状分析论文

　　张青锋等研究发现恶性疟原虫中存在一种核糖核酸外切酶PfRNaseⅡ，该酶通过降解新生RNA 从而介导与重症疟疾相关的毒力基因(upsA 亚类基因)的沉默。

　　本实验通过体外扩增恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ的催化活性区，构建重组表达载体，然后利用原核表达系统诱导表达GST标签融合蛋白质，纯化后进行RNA降解活性测定，为解析PfRNaseⅡ基因结构组成及其降解机制研究奠定基础。

　　材料与方法

　　1材料

　　1.1虫株与菌株大肠埃希菌DH5α、BL21-Codon-Plus(DE3)和恶性疟原虫3D7虫株均由本室保存。

　　1.2主要试剂ExTaq? DNA 聚合酶，dNTP，DL2000TMDNAMarker，DL15000TMDNAMarker，限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，T4DNA 连接酶，pMDTM18-TVectorCloningkit均购自于大连宝生物公司;Glutathione-SepharoseTM4B 购于美国GEHealthcare公司;GST-tagMousemAb购自于天津三箭生物有限公司;碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG和BCIP/NBT购于美国Sigma公司;DNAGelExtractionKit和PlasmidMiniprepKit购于美国BIOMIGA公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

　　2方法

　　2.1序列分析与引物合成根据疟原虫专业网站(www.plasmoDB.org)提供的序列信息，对恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ (PF3D7_0906000)基因编码区进行保守结构域分析，显示该蛋白质氨基酸序列的870～1322区段为RNBdomain，该结构域是RNaseⅡ的特征性结构域和催化活性区。根据编码序列设计特异性引物，并在引物的5'端分别添加酶切位点。上游引物：5′-GGATCCTTAGAAAAATATATGTTGAAAAGCT-3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点序列)，下游引物：5′-GAATTCAATATTATCTTGATCAATTAAACTTTGT-3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点序列)。引物由长春库美生物公司合成。

　　2.2目的片段的扩增以cDNA(本室保存)为模板，PCR扩增上述的目的基因片段。PCR 反应程序：94℃预变性4min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环;72℃再延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　2.3重组表达载体的构建取PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、测序鉴定为阳性的重组pMD18-T-PfRNaseⅡ载体质粒与原核表达载体pGEX-4T-1质粒分别进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切(37℃酶切反应2.5h)，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后，按BIOMIGA试剂盒说明书切胶回收。将回收的载体片段与目的片段按摩尔比5︰1混合，在T4DNA连接酶的作用下于16℃水浴连接过夜，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、双酶切、测序鉴定正确的重组表达载体质粒pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ转入BL21-CodonPlus(DE3)中。测序鉴定均由哈尔滨博仕生物公司完成。

　　2.4融合蛋白质的诱导表达与纯化将转染pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ的DE3划线接种于固体LB培养基中37℃培养12h以上，挑取单个菌落接种于5ml液体LB中扩大培养。取适量菌液按1︰100接种继续扩大培养，当A600值为0.6左右时，加入终浓度为100μmol/LIPTG诱导表达目的蛋白质。于16℃诱导表达12h后收集菌体，用适量TBS重悬，然后加入终浓度为1% TritonX-100和2mmol/L的PMSF混匀，超声破碎菌体。用Glutathione-SepharoseTM4B树脂纯化目的蛋白质pGEX-PfRNaseⅡ。以相同的流程纯化GST标签蛋白质。纯化的目的蛋白质用预冷的Tris缓冲液(TBS)透析，按说明书操作。为了便于PfRNaseⅡ的水解活性测定，在纯化pGEX-PfRNaseII融合蛋白质和GST 标签蛋白质时，全程尽量避免PO43-污染，故用TBS替换PBS。纯化的目的蛋白质通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定其浓度和纯度。

　　2.5pGEX-PfRNaseⅡ水解活性测定反应体系为12.5μl，包含终浓度为0.8μmol/LpGEX-PfRNaseⅡ，20 mmol/LTris-HCl (pH =8.0)，100mmol/LKCl，5mmol/LMg2+，1U/μlRNasin和4μmol/L单链RNA(ssRNA)或2μmol/L双链RNA(dsRNA)。同时设置等摩尔数的GST标签蛋白为阴性对照。37℃孵育适当时间后加入等量含30mmol/LEDTA的上样缓冲液终止降解反应。反应终产物进行20%7mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶(7mol/LU-PAGE)电泳检测。ssRNA 和dsRNA 均由苏州吉玛公司合成。

　　2.6观察镁离子对pGEX-PfRNase Ⅱ 体外降解RNA的影响有研究表明，核糖核酸外切酶降解RNA需要二价金属离子的参与。为了观察Mg2+对pGEX-PfRNaseⅡ体外降解RNA 的影响，本实验设置0～20mmol/L梯度浓度的Mg2+ 进行目的蛋白RNA水解活性测定定，反应体系中的其他成分与方法2.5一致。

　　结果

　　1目的片段的扩增以cDNA 为模板，利用PCR 方法扩增PfRNaseⅡ的RNB催化区(870～1322位氨基酸区段)的编码基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大小在1000～2000bp之间，与预期值(1404bp)相符，不含内含子的编码区片段扩增成功。

　　2重组pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表达载体的构建及鉴定按常规方法构建pMD18-T-PfRNaseⅡ重组T载体质粒和pGEX-4T-1 表达载体质粒，BamHⅠ 和EcoRⅠ双酶切结果。回收载体和目的基因片段，于16℃连接过夜，构建重组pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表达载体，经PCR、双酶切、测序鉴定均正确，重组表达载体构建成功。

　　3目的蛋白质的表达纯化及鉴定

　　pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ转染DE3后用终浓度为100μmol/LIPTG诱导12h，成功表达目的蛋白。纯化的pGEX-PfRNaseⅡ融合蛋白和GST标签蛋白的SDS-PAGE结果。以GST-tagMousemAb为一抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG 为二抗，进行Westernblot，目的蛋白能被相应一抗识别。根据SDS-PAGE 结果估计融合蛋白pGEXPfRNaseⅡ浓度约为80μg/ml，GST标签蛋白质浓度为500μg/ml。

　　4pGEX-PfRNaseⅡ的水解活性

　　将pGEX-PfRNaseⅡ与ssRNA 混合后于37 ℃孵育30min即可见明显的降解发生，等量的GST标签蛋白与等量的ssRNA在37℃孵育120min后仍无明显的降解发生。在同等条件下，pGEX-PfRNaseⅡ和GST标签蛋白均不能降解dsRNA。

　　5二价金属离子对pGEX-PfRNaseⅡ催化活性的影响

　　为了确定Mg2+ 对PfRNaseⅡ酶活性的影响，实验设置0(EDTA组)、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20mmol/L共10个Mg2+ 梯度。在不同Mg2+ 条件下，pGEX-PfRNaseⅡ与ssRNA 在37 ℃孵育90min后经20%7mol/LU-PAGE检测，呈现不同的降解效果。在低浓度Mg2+ 条件下，pGEX-PfR-NaseⅡ降解活性较强;而在EDTA的存在下，pGEXPfRNaseⅡ的活性受到明显抑制。表明Mg2+ 为pGEX-PfRNaseⅡ发挥降解活性所必需，且在低浓度时活性较强，高浓度时活性受到抑制。

　　讨论

　　疟疾是由疟原虫感染引起的寄生虫病，通过受感染的蚊虫叮咬传播。世界卫生组织最新报告显示，全球大约有32亿人口仍处于疟疾感染的威胁下，仅2015年就新增加2亿感染病例和40多万的死亡病例。虽然人类的抗疟行动取得了一定成绩，但随着虫体耐药性的产生和扩散，研制开发有效的疫苗和新型抗疟药物刻不容缓。解析疟原虫的抗原变异机制和关键毒力基因的调控机制，对研制新型疟疾疫苗或药物具有重要意义。

　　大量研究证实，由Var基因家族编码的恶性疟原虫红细胞膜抗原1(PfEMP1)是虫体抗原变异的主要效应分子，也是介导细胞粘附和玫瑰花环形成的重要致病因子，在恶性疟原虫免疫逃避和虫体致病中发挥重要作用。因此，Var基因的调控机制一直是疟疾研究领域的重点和热点。虽然关于Var基因的调控已经在转录水平和表观遗传水平取得一定的进展，但关于Var基因完整的调控网络尚不十分清楚。Zhang等报道恶性疟原虫PfRNaseⅡ通过降解新生的RNA介导与重症疟疾相关的毒力基因，首次从转录后水平研究Var基因的调控机制，这对完善Var基因的调控机制具有重要意义。

　　生物信息学分析PfRNaseⅡ序列发现，该蛋白870～1322氨基酸残基区段为RNB结构域。RNB结构域是RNB家族成员特征性的功能结构域，属保守功能域，而RNB家族成员又是核糖核酸外切酶的重要组成部分。本研究利用原核表达系统制备含PfRNaseⅡ预测的RNB功能区的GST 标签融合蛋白。体外RNA 降解试验显示该蛋白可水解ssRNA 而不能水解dsRNA，且其降解ssRNA的活性受反应体系中Mg2+ 浓度的影响。可见，PfRNaseⅡ具有ssRNA水解活性，其水解反应需要二价金属离子的参与，为PfRNaseⅡ的降解机制及其在疟原虫生长发育中的作用研究奠定了基础。

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