多酚氧化酶的研究现状
论文摘要：多酚氧化酶被认为是导致酶促褐变反应的主要因素，对其的研究也在逐步深入。文章结合多酚氧化酶的结构特性、催化机理、活性影响因素、生理功能、活性测定和分离纯化等方面的内容，对多酚氧化酶的研究现状进行了综述。
论文关键词：多酚氧化酶(PPO);催化机理;生理功能
多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)属核编码含铜金属酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫等机体中。它可分为酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶、漆酶等三大类，由于其能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质，因此被认为是导致酶促褐变反应的主要因素。早在1937年Kubowitz就在Warburg实验室中第一次分离得到了多酚氧化酶[2，3]。随着研究的不断深入，对多酚氧化酶各方面的认识也在不断加深，本文就多酚氧化酶的结构特性、催化机理、生理作用等方面做简要的介绍。
一、多酚氧化酶PPO的结构特性
PPO是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生。植物中的PPO包括一些由核编码的，多基因的家族。在蕃茄中，已有几个PPO的基因被分离出来，并从结构上将其分为三组。在马铃薯中，有4条独立的cDNA被克隆，每一个都显示了独特的空间图景。在扁豆中，有三条与PPO有关的cDNA克隆已被建立。所有的PPO基因都有两个区域，一是与Cu有关的编码区，另一个是引导肽(transitpeptide)，以便能进入质体。PPO的前体(含有引导肽的)约60-75KDa，而成熟的PPO(去除了引导肽的有活性的形式)约45-69 KDa，由于这种潜在的酶活性的存在，使PPO活性的问题研究起来十分复杂。未激活的PPO可被陈化作用、加盐、去污剂(如SDS)、蛋白酶切或尿素的加入等激活。
二、PPO的催化机理
多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醒类物质。在茶儿茶素氧化PPO底物儿茶素(catechin)类能和许多金属离子络合，Cu2+离子形成的配位物中的配位数为4或6，可以从配位体的配位键来阐明PPO的催化生化机理。PPO的多肽链通过自身的折叠卷曲，形成具有一定构象的高级结构。Cu2+与多肽链上的氨基酸残基以配位键相连，主要有His-His和Cys-His残基作为铜离子的配基，形成具有特定立体结构的活性部位。当邻苯二酚基和底物存在时，由于其“靠近”及“定向”效应，使多肽链和底物的空间构象发生改变，相互契合，从而使底物进入活性中心，邻苯二酚基上的二个羟基与多肽链上的氨基酸残基以氢键相连，形成酶与底物的复合物，由于复合物的不稳定性，多肽链构象发生扭曲，氢键断裂，H被附着在多肽链上，酶与底物不再契合，两者都同时发生构象转变，于是产物脱离了活性部位，成为邻醌。邻醌可发生一系列次生氧化作用，形成了多种氧化产物。酶又通过脱氢作用，发生构象回转，恢复以前的天然构象，重新成为具有催化能力的蛋白质。
三、PPO的生理功能
高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果发生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失。
PPO作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递;PPO还可促进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。PPO的`作用方式有：
1.如番茄的具腺毛状体中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用[12]。
2.通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制，直接抵御昆虫和病原体[13]。
3.醌的毒性直接发挥抗病作用。
4.如番茄中PPO克隆的反义表达可对基因家族的各成员进行负调节，对病原体产生超敏感性(感受性过敏)[14]。
5.邻醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散[15]。
PPO与水果和作物的褐变有关，为了防止水果褐变保持水果的新鲜性，生产上运用多种方法来降低水果中的PPO含量，例如涂以抗坏血酸、柠檬酸为主剂的复合护色剂，杏用沸水烫4min基本控制PPO活性，对莱阳梨进行套袋抑制PPO活性等。
四、PPO活性影响因素
随着诱导剂特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等电点等都有所改变。生长培养基的成分也可部分地控制PPO酶产量，例如：硫酸铵抑制PPO形成，而谷氨酸促进PPO形成。在植物组织中激活剂可打破PPO的潜伏状态。在蚕豆中PPO可被游离脂肪酸酸化激活，菠菜类囊体中分离出来的PPO可被亚麻酸激活。这表明PPO的天然激活剂确实存在。同样PPO的天然抑制剂也存在，例如菠菜叶中的草酸盐，茶叶中的橡黄素、白花青素等。矿物质营养例如钙或磷的缺乏可导致PPO活性的降低;硼缺乏对单子叶植物无影响，但可导致双子叶植物中PPO活性的增加。植物正常新陈代谢受到干扰也会导致PPO活性的改变：例如贮存时通风不好或生长时水分不够均可引起PPO水平的升高。铜是PPO的组成部分，铜缺失时苜蓿叶片不能表现出PPO酶活性，即使后来再补充铜也不行，这说明全酶只能在发育的早期形成。
钟瑾等[16]用自制壳聚糖与戊二醛交联对PPO固定化进行了初步探讨，表明当戊二醛浓度为2%时，酶活力最高，并提出在确定给酶量时，要兼顾酶活和回收率二者的影响以达到最佳。李荣林等[17]应用海藻酸钠和戊二醛交联法对PPO进行包埋取得了成功，并对其性质进行了系统研究发现[18]：将酶的最适pH上移至7.0，最适温度上升至40℃，酶对金属离子的适应性增强，对抑制剂敏感性下降，低温贮存下，半衰期由3个月上升到221天。
五、PPO活性的测定方法
测定多酚氧化酶活性的方法有：检压法、极谱电极法、比色法、碘量滴定法等[19]。最早是将酚或邻苯二酚作为底物用滴定法来测定多酚氧化酶活性，后来发现用极谱电极法测定O2消耗更精确一些[20]。但是，无论是滴定法还是极谱电极法都必须经过种子研磨的过程，为了测定的省时方便， Kruger[21]首创了无须研磨种子就可以测出小麦多酚氧化酶活性的方法:种子在水中浸泡16h，然后加入邻苯二酚，反应30min后用动态的微盘计数器测溶液的颜色变化。将这种方法与研磨种子氧电极法比较，相关系数为0. 85。伴随着科技的发展和分光光度计的应用， Anderson[22]将整粒种子测定方法做了进一步改进: 3～5个整籽粒或0.4g被钳碎的种子放入离心管中，加入用50mM MOPS缓冲液配制的L-DO-PA，室温振荡反应30min或37℃振摇5min后过滤，然后在分光光度计下测定475nm吸收值，这种方法与研磨种子氧电极法比较，相关系数为0.86。