林可霉素生物合成技术

林可霉素生物合成技术

　　林可霉素生物合成技术

　　【摘要】在合成培养基中利用林可链霉菌发酵生产林可霉素。

　　当向培养基中加入生物素和氨基酸时，林可霉素的产量受到很大影响。

　　【关键词】林可霉素 生物合成

　　林可霉素是一种高效广谱抗生素，临床用于由抗革兰阳性菌引起疾病的治疗。

　　林可霉素A的分子式为C18H34N2O6S，分子量为406.56，它与林可霉素B在结构上的区别为：林可霉素A 4位上为正丙基，而林可霉素B4位上是乙基， 两者在药理上存在着很大的区别，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但对人的毒副作用较大。

　　我国药典要求成品中B含量小于5%。

　　本文采用合成培养基进行摇瓶发酵实验，选择玉米浆中含量较丰富的D�生物素、L�谷氨酸、L�缬氨酸等15个因子首先进行两水平因子设计实验，以筛选出显著影响因子，然后进行响应面设计实验，通过软件分析得到优化的发酵培养基配方。

　　一、 材料与方法

　　1、 菌种

　　林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)L�427，由江西国药有限公司提供。

　　2 、 培养条件与培养方法

　　种子培养种子摇瓶于30℃，220r/min培养48h。

　　摇瓶发酵培养 按30%的接种量将种子液接入发酵培养基，30℃，220r/min，培养168h。

　　3、 生物效价的测定

　　采用管碟法。

　　鉴定菌为藤黄八叠球菌[Sarcina lutea，CMCC(B)28001]，由江西国药有限责任公司提供。

　　林可霉素(lincomycin)标准品购自Sigma公司。

　　二、结果与讨论

　　1 、 实验设计

　　通过两水平因子设计(2 Level Factorial Design)实验可迅速找出生物素和氨基酸中对林可霉素的发酵生产有显著影响的因子，进一步对显著影响因子进行响应面设计(response surface design，RSD)实验，对结果进行优化分析可得到优化配方。

　　所采用的实验设计、数据分析软件为Design Expert 7.0。

　　(1)两水平因子设计 该设计可从大量影响因子中快速找出显著影响因子，设计方案和结果如表1所示。

　　用软件进行分析，得知设计模型的F值为18.05，由于噪声影响而出现大于F值的概率仅为0.02%，故本设计模型是显著的。

　　曲率的F值为19.62，出现比F值大的几率仅为0.16%，说明模型的响应曲面图显著弯曲，提示模型具有很强的显著性。

　　鉴于此，选择生物素、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作为影响发酵生产林可霉素的关键因素，进行响应面设计。

　　其他可信度较小的因素对林可霉素的发酵生产无显著影响，在下一步的培养基优化中不予考虑。

　　(2)响应面设计 将6个显著影响因子进行响应面设计中的中心组合设计(central composite design，CCD)，可得出响应值(生物效价)关于各显著影响因子的多项二次拟合方程，再对响应面进行分析，可得响应值与各因子之间、因子与因子之间的相互关系，经过综合分析得出整个响应区域中响应值的最优值和影响因子含量的最佳组合。

　　①中心组合设计 6个显著影响因子D�生物素(a)、L�谷氨酸(b)、L�缬氨酸(c)、L�蛋氨酸(d)、L�亮氨酸(e)和L�酪氨酸(f)的浓度范围分别为30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。

　　设计方案和实验结果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分别表示对应影响因子的最低浓度值、中间浓度值和最高浓度值。

　　软件分析得知，模型的拟合度(R�Squared)为0.997，说明预测值与实测值之间具有高度的相关性;校正决定系数(Adj R�Squared)为0.9809，说明该模型能解释98.09%响应值(Titres)的变化,仅有总变异的1.91%不能用此模型来解释;模型的信噪比(Adeq Precision)为23.723，一般来说，模型的信噪比大于4就是较好的模型，进一步说明本模型设计是非常成功的。

　　②分析与优化 利用软件对生物效价预测值与显著影响交互项ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之间的响应面图进行分析，得知上述交互作用项对生物效价的影响很大，在低浓度范围内，生物素浓度越低，生物效价的预测值越大;谷氨酸和缬氨酸之间、缬氨酸和亮氨酸之间以及亮氨酸和酪氨酸之间对生物效价的影响具有显著的正协同效应;缬氨酸和蛋氨酸对生物效价的影响存在拮抗效应，缬氨酸浓度较高和蛋氨酸浓度较低时，预测效价值较高。

　　对上述结果进行分析可知，低浓度的生物素对林可链霉菌的糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢有促进作用;林可链霉菌对谷氨酸的需求量较高，可能是因为其参与较多的脱氨基和转氨基反应，生成了较多的α�酮戊二酸等中间产物，一方面对三羧酸循环有强化作用，另一方面可为林可霉素的生成提供丰富的中间产物;缬氨酸和亮氨酸为分支氨基酸，它们脱氨基可生成支链脂肪酸，对林可链霉菌的生长有刺激作用;酪氨酸为林可霉素A合成的前体，补入适量的前体，可提高林可霉素A的合成速率和产量。

　　蛋氨酸为去甲基林可胺转甲基反应的甲基供体，它对林可霉素的合成速率可能具有较大的限制作用，而缬氨酸对林可霉素的生长具有刺激作用，菌体生长与林可霉素的合成在某种程度上说是一种相互制约的关系，这样就表现为蛋氨酸和缬氨酸之间的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有较高的菌浓，故培养基中应适当增加缬氨酸的浓度，相应适当降低蛋氨酸的浓度。

　　3 、 验证实验

　　为了检验优化结果的有效性，在摇瓶中同步进行了优化组、对照组I(培养基中无生物素和氨基酸)和对照组II(培养基中按原配方加入6个显著影响因子)的验证实验，结果如表4所示。

　　三、结论

　　在化学合成培养基中用林可链霉菌发酵生产林可霉素，通过两水平因子设计实验对生物素和氨基酸组分进行筛选，得出六个对生物效价有显著影响的因子：D�生物素、L�谷氨酸、L�缬氨酸、L�蛋氨酸、L�亮氨酸和L�酪氨酸;通过响应面设计实验和软件的优化分析得到上述六个显著影响因子的含量分别为30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L时，最终发酵液的最大预测效价为2275μg/ml。

　　采用优化配方进行摇瓶实验，最终发酵液的生物效价为2116μg/ml;而采用对照I和II配方进行摇瓶实验，最终发酵液的生物效价分别为893和1481μg/ml，即采用优化配方相对于采用对照I和II配方在生物效价方面提高的百分含量分别为136.62%和42.88%。

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