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极低频电磁场照射后细胞间的通讯
摘要：低频脉冲电磁场能够影响成骨细胞的增殖, 但其机理还有待研究。 使用15 Hz, 4 mT 矩形电磁场照射新生鼠颅骨细胞, MTT 方法测量细胞的增殖率, 通过电磁屏蔽与光隔离方法研究细胞间的通讯。 结果表明, 电磁场照射后的细胞能够辐射一种光信号, 受电磁场照射的成骨细胞可以通过这种光辐射的通讯方式促进未受电磁场照射的正常成骨细胞的增殖(P < 0。05)。
关键词：电磁场、成骨细胞、增殖、通讯
低频脉冲电磁场(PEMF)对骨不连病人的治疗及骨愈合等疾病有显著的促进作用[1,2], 特别是由于近年来环境中低频电磁场污染的增加, 低频电磁场生物效应已经成为了社会广泛关注的热点问题, 并引发了电磁场生物效应机理研究的热潮[3~5]。 从电磁场作用后细胞的响应来看, 电磁场可以通过细胞外或细胞内钙离子途径直接影响成骨细胞的生长与分化[6~8], 电磁场也可能通过对DNA的直接作用影响细胞的转录功能[9]。 从电磁场特征来看, 目前能够肯定的是电磁场的生物效应存在强度与频率窗口[10]。 电磁场生物效应机理的研究已经有很多年的历史, 但仍然没有取得突破性的进展, 还存在很多问题, 表明电磁场生物效应的复杂性, 也提示我们应当更深入地研究其机理效应。 本文研究了电磁场刺激后细胞间的通讯问题。
1 材料与方法
(ⅰ) 试剂。 本研究使用试剂包括DMEM 培养液(GIBCO 公司), 新生牛血清(杭州四季青生物制品公司), MTT(Sigma 公司)。
(ⅱ) 电磁场的产生。 电磁场发生仪自行研制,能够在多层线圈绕制的螺线管内产生频率、强度可调的矩形、正弦、三角等多种波形的低频电磁波。 为了保证螺线管中电磁场比较均匀, 螺线管的直径与长度分别设计为5 和25 cm, 螺线管中磁感应强度按理论公式计算: B = μ0nI ( μ0 为真空磁导率, 其值为4π × 10−7H/m, n 为线圈单位长度的匝数, I 为通过线圈的电流强度), 电流使用示波器及A622 探头测量获得(Tektronix,USA)。 本研究所用矩形波电磁场参数为: 频率15 Hz,峰值强度4 mT, 占空比15%。
(ⅲ) 细胞培养。 无菌条件下, 取出生24 h 内的SD 大鼠颅盖骨(购于第四军医大学实验动物中心),胰蛋白酶(1。25 g/L)消化20 min; 用10%血清的DMEM 培养基冲洗两遍, 接种于培养瓶中, 待细胞长满培养瓶壁时传代培养。 第3 代细胞用含10%血清的DMEM 培养基稀释成5×104/mL 细胞的悬液, 以每孔200 μL 接种于由96 孔培养板加工而成的小孔中继续培养24 h, 而后进行分组实验。 实验分对照组与电磁照射组, 实验时对照组与电磁照射组分别置于两个完全一样的螺线管中, 对照组不加电磁场放置30min, 电磁照射组加磁场照射30 min, 磁场方向与培养皿底部垂直, 而后继续培养24 h, 照射两次后用MTT 法检测成骨细胞的增殖率。 为保证数据的准确性, 每个实验至少重复2 次。
(ⅳ) 成骨细胞增殖检测。 96 孔培养板的每孔内加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL, 37℃孵育4 h, 吸尽培养基并于每孔加入二甲基亚砜150 μL, 振荡10min, 用酶标仪(TECAN, 澳大利亚)测量570 nm 波长时的光密度(A)值。
(ⅴ) 数据处理。 统计分析使用了Sigma Plot 软件中的t 检验, 数据表示为X ± SD。
2 结果
电磁屏蔽实验分为5 组。 其中有3 个对照组, 代分别称为对照组、电磁场屏蔽对照组(ESC)、无电磁场屏蔽对照组(ENSC)。 另2 个为电磁场照射组, 分别为电磁屏蔽的电磁场照射组(ESS)和无电磁屏蔽的电磁场照射组(ESNS)。 对照组与电磁照射组的实验方法同上, 但电磁照射结束后, ESC 组与ESS 组分别用200 目铜网制成的长方体箱包裹, 贴在一起共同放入培养箱培养, ESNS 组与ENSC 组直接贴在一起放入200 目铜网制作的长方体箱中共同培养, 对照组置于铜网中单独培养, 结果见图1。 可以看出, 其他4 组与对照组差异显著(P < 0。05, n = 8), 但4 组之间无显著差异(P > 0。05, n = 8)。光隔离实验也分为5 组。 其中3 个对照组分别为对照组、光未隔离对照组(LNIC)、光隔离对照组(LIC),2 个电磁照射组分别为光隔离的电磁场照射组(ELI)与光未隔离的电磁场照射组(ELNI)。 电磁照射的实验方法同上, 但电磁照射结束后, LIC 与ELI 组用黑色玻璃片隔离后贴在一起共同放入培养箱培养,LNIC 组与ELNI 组用透明玻璃片隔离后贴在一起放入细胞培养箱培养, 对照组单独培养, 结果见图2。