HPLC法测定炔雌醇脂质体的含量及包封率论文
目的 建立测定炔雌醇脂质体的含量及包封率的方法。方法 采用HPLC法，以Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)为色谱柱，流动相为甲醇?水(体积比70∶30)，柱温为室温，流速为1.0 mL·min-1，紫外检测波长为281 nm。结果 炔雌醇与卵磷脂、溶剂峰能有效分离，炔雌醇在2 ～20 μg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.999 7, n=10），回收率在98.0%～102.0%之间。结论 所建立的方法简便、准确、灵敏度高、方法可靠，可作为炔雌醇脂质体的含量及包封率的质量控制方法。Abstract:Objective To establish an HPLC method for the analysis of ethinylestradiol content and entrapment efficiency of ethinylestradiol liposomes.Method Samples were analyzed on an Agilent HC?C18 column（4.6 mm× 250 mm，5 μm）using methanol?water（70∶30）as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and detection wavelength 281 nm.Results Ethinylestradiol had a good linearity over the range of 2～20 μg·mL-1 (r=0.999 7, n=10), the average recovery was between 98.0% and 102.0%. Conclusion This method is simple, accurate and sensitive for the quality control of the liposomes.
Key words:HPLC; ethinylestradiol liposomes; ethinylestradiol; entrapment efficiency
炔雌醇又名乙炔雌二醇，为3?羟基?19?去甲?17α?孕甾?1，3，5（10）?三烯?20?炔?17?醇。化学结构式为［1］：
炔雌醇作为雌激素类药，其对下丘脑和垂体有正、负反馈作用，小剂量时可刺激促性腺素分泌，其活性是雌二醇的7～8倍，己烯雌酚的20倍，临床多用于月经紊乱，如闭经、月经过少、功能性子宫出血、绝经期综合征、子宫发育不全、前列腺癌等疾病的治疗，具有疗效确切、价格适中等优点，易被广大妇女所接受。但其亦有许多副反应，如恶心、呕吐、阴道出血、诱发子宫内膜癌等［2,3］，因而严重地影响到病人的用药安全。将其制备成脂质体，可以有效地减少给药次数和给药量，提高生物利用度，降低毒副作用。
本文制备了炔雌醇脂质体，并采用反相高效液相色谱法测定炔雌醇脂质体的含量和包封率［4,5］。实验结果表明，该方法准确可靠，可作为炔雌醇脂质体质量控制的一个有效手段。
1 仪器与试药
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996紫外检测器，Waters 717自动进样器，Waters Millennium色谱工作站；Agilent HC?C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm) 色谱柱；日立U?3010/3310紫外可见分光光度计(北京天美公司)；Nicomp 370激光散射粒径仪（ 加拿大Santa Burbara公司），挤压器(加拿大Lipex Biomembranes公司) 。甲醇(色谱纯，SK Chemicals)；炔雌醇原料药（上海医药集团有限公司）；精制蛋黄卵磷脂egg phosphatidylcholine (西安力邦制药有限公司，质量分数98%) 。
2 方法与结果
2.1 脂质体的制备
采用薄膜法制备炔雌醇脂质体［6-8］：按药物含量15%～30%（摩尔比）称取炔雌醇原料药和蛋黄卵磷脂，将其溶于适量甲醇?氯仿（体积比1∶2）中，漩涡混合均匀后，50 ℃下氮气吹干，再用真空泵将剩余有机溶剂抽干。加入磷酸盐缓冲液漩涡混合，高速剪切1～2 h，用脂质体挤压器将其依次经过400、200、100 nm聚碳酸盐滤膜挤压，即得。获得的脂质体的平均粒径都在110 nm左右，电镜观察，呈现均匀的圆球状。
2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流动相：甲醇?水(体积比70∶30)；柱温：室温；流速为1 mL·min-1；紫外检测波长为281 nm；进样量50 μL。
2.3 干扰试验
称取20 mg炔雌醇置10 mL容量瓶中，加入甲醇?水（体积比70∶30）溶解并稀释至刻度，得炔雌醇对照品溶液。分别精密吸取空白脂质体及炔雌醇脂质体各0.2 mL，用甲醇?水（体积比70∶30）稀释至2.0 mL破乳，振荡混匀，分别得到空白脂质体溶液和脂质体炔雌醇溶液。将上面制备的3种溶液过0.22 μm有机滤膜，各取50 μL进样分析，得色谱图。结果表明，卵磷脂和炔雌醇的保留时间相距很大，卵磷脂对炔雌醇的测定无干扰。炔雌醇对照品和炔雌醇脂质体的峰面积基本相同，证明卵磷脂没有吸附炔雌醇，也没有改变炔雌醇的性质和结构，见图1。
2.4 线性关系考察
取炔雌醇对照品溶液，按上述色谱条件，分别进样1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μL，以峰面积（A×10-6）为纵坐标，炔雌醇质量浓度（μg·mL-1）为横坐标进行线性回归，得线性回归方程：A=0.4026 C-0.4240， r=0.999 7， 结果表明炔雌醇的质量浓度在2～20 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
取炔雌醇对照品溶液50 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次，测定炔雌醇的峰面积，计算其RSD值为0.75%，表明该法精密度良好。
2.6 稳定性试验
取室温下保存的质量浓度为40 μg·mL-1的对照品溶液于0，6，12，18，24 h分别进样，记录峰面积，计算其RSD值为1.08%，表明溶液在室温放置24 h稳定。
2.6 回收率试验
精密称取炔雌醇对照品2.5 mg置50 mL容量瓶中，甲醇?水（体积比70∶30）溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。取计算量的空白脂质体（相当10 mg蛋黄卵磷脂）置1～6号50 mL容量瓶中，分别加入1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL炔雌醇对照品储备液，用甲醇?水（体积比70∶30）溶解并稀释至刻度，分别进样50 μL，在281 nm波长处测定峰面积，每个样品连续测定5次，代入标准曲线，计算回收率，得平均回收率为100.6%，RSD为1.5%，表明回收率结果良好。
2.7 炔雌醇脂质体含量及包封率的测定
分别精密吸取不同配方的炔雌醇脂质体各0.2 mL，加流动相破乳并稀释至2.0 mL, 摇匀，作为供试品溶液，取上述溶液各50 μL进样，记录色谱图。按外标法计算供试品溶液中炔雌醇的含量及包封率，不同配方的炔雌醇脂质体中药物的含量及包封率结果见表1。表1 炔雌醇脂质体中的含量及包封率（略）
3 讨 论
3.1 检测波长的选择
称取炔雌醇原料药、蛋黄卵磷脂、炔雌醇脂质体各适量，加甲醇?水溶解，分别在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果测得在281 nm处炔雌醇原料药和炔雌醇脂质体都有最大吸收，所以选择281 nm作为检测波长。
3.2 流动相的选择
最初选择纯甲醇溶解炔雌醇脂质体制备样品溶液，出现大量白色沉淀物，当加入少量纯水后，白色沉淀物减少，于是配制不同比例的甲醇?水溶液，当甲醇?水溶液体积比为70∶30时，炔雌醇脂质体溶解澄清。所以采用甲醇?水（体积比70∶30）作为流动相，在281 nm波长处其他成分无干扰影响，灵敏度高，准确性好，色谱峰分离优良，保留时间合适。
.3 在脂质体的'制备过程中，最后一个制备步骤是通过聚碳酸盐膜挤压脂质体使其达到需求的粒径，但是随着药脂比的不断增大，有一部分药物在挤压时已经析出，沉淀在聚碳酸盐膜上，未进入脂质体体系，因此在高载药实验中，最终含药量要少于起始加入量。
.4 比较了不同配方的炔雌醇脂质体的包封率。当药物在脂质体中的含量相对适中时，药物的包封率非常高，这是由于炔雌醇是脂溶性药物，在磷脂双层膜中溶解性能好。但是当制备过程药物与磷脂的比例增加到一定值以上，炔雌醇的溶解能力下降，所以能够包裹进脂质体中的药物达到了一定的饱和。这个分析结果在实验中得到了验证，在制备过程中观察到炔雌醇在挤压器的滤膜上析出时，所测得的包封率都较低，药物析出越多，包封率也越低。
【HPLC法测定炔雌醇脂质体的含量及包封率论文】相关文章：
HPLC法测定益肝灵片中水飞蓟宾的含量02-03
HPLC法测定不同采收期小叶榕叶中异牡荆苷的含量论文01-03
HPLC测定小麦胚芽油营养胶囊中维生素E的含量论文01-03
HPLC法同时测定复方利血平氨苯蝶啶片中3组分的含量论文01-03
HPLC法同时测定美敏伪麻口服溶液中3组分的含量论文01-03
利用HPLC-FLD对大鼠5-HT含量测定实验分析的药学本科毕业论文02-21
气相色谱法测定角鲨烯软胶囊中角鲨烯含量02-12