利用HPLC-FLD对大鼠5-HT含量测定实验分析的药学本科毕业论文

药学毕业论文 时间:2018-05-18 我要投稿

  1 仪器和试剂

  美国Waters高效液相色谱仪( 510泵, 474荧光检测器, 717自动进样器及柱温控箱等);Empower色谱数据工作站;瑞士Mettler万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平;美国Milli-Q纯水器;三洋MDF-382E超低温冰箱,Beckman 21R高速冷冻离心机,上海金达生化仪器厂XUF-1高速分散器。

  5-羟色胺(5-HT)标准品(1357359 33907213 美国Fluka公司);甲醇为江苏汉邦科技有限公司的色谱纯甲醇;其它试剂均为分析纯。

  2 方法

  2.1 色谱条件色谱柱为Alltima C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.1 mol/l磷酸二氢钾溶液-甲醇(9∶1 V/V);单泵等度洗脱;流速1.0 ml/min,;λEx:254 nm;λEm:338 nm;柱温:35℃。

  2.2 标准品溶液的配制精密称取5-HT标准品适量,用0.1 mol/L盐酸制成0.35 mg/ml的对照品贮备液,避光冷藏保存。按实际检测需要,用0.1 mol/L盐酸溶液稀释到相应的溶度,供检测用。

  2.3 大鼠海马脑组织匀浆样品的制备取大鼠海马组织,称湿重,以1∶10的比例加入0.4 mol/L的高氯酸,(即每100 mg脑组织加1 ml 0.4 mol/L的高氯酸)。冰浴下充分匀浆,冰浴沉淀30 min,于4℃,10 000 r·min-1离心15min,取上清液,每毫升上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液、混匀后,于4℃、3 000 r·min-1离心5 min,取上清液,过0.45 μm滤膜,分装,于-80℃保存待用。

  3 结果

  3.1 标准液和样品液的色谱分离图在选定的色谱条件下,标准品液与按“2.3”项下方法处理的样品分别进样的色谱图见图1~2,从图中可知,5-HT 峰形良好,无杂质峰干扰,其保留时间为9.9 min。

  3.2 线性范围、检出限采用外标法,取0.7 μg·ml-1的5-HT标准液在选定的色谱条件下分别进样1,3,6,9,12 μl,以峰面积Y为纵坐标、进样量X(ng)为横坐标作图,检测线性范围为0.70~8.40 ng(r=0.999 9);峰面积与进样量呈良好的线性关系;以信噪比为 3(S/N =3)时,计算检出限为1.27×10-3 ng。

  3.3 精密度、重复性实验在上述色谱条件下,取浓度为0.7 μg·ml-15-HT的标准液,重复测定5次,测得日内精密度相对标准偏差(RSD)为0.7%,表明实验方法精密度良好。

  取同一样品平行5份,按“2.3”项下方法处理,在上述色谱条件下,连续进样5次,考察样品峰面积的重复性,结果相对标准偏差(RSD)为2.8%。表明实验方法具有很好的重复性。

  测定方法选择本文对5-HT含量检测比较了高效液相-电化学(HPLC-ECD)和HPLC-FLD,发现应用HPLC-ECD方法时,检测器对流动相的改变较敏感,使系统不易稳定。最终选择了高效液相分析中高分辨率,高灵敏度的荧光检测法。建立了适用于检测5-HT物质简单、快速、重复性好的HPLC-FLD。在探索该测定方法时,作者观察到海马组织样品的处理要快,制备好的待测样品要保存在-80℃冰箱内,这对得到良好的分析结果至关重要。

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