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维A酸对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原和端粒酶活性的影响论文
【摘要】 目的 观察维A酸（RA）对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原（PCNA，用增殖指数 PI表示） 和端粒酶活性（用hTERT表示）的影响。方法 采用甲硝基亚硝基胍（MNNG）、0.03%雷尼替丁、56 ℃15%盐水、0.85%脱氧胆酸钠、40%乙醇、饥饱失常等多种因素制作大鼠胃癌前病变模型，免疫组化方法检测正常组、自然恢复组、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组大鼠胃黏膜组织中 PI 和 hTERT 蛋白表达情况。结果 正常组和RA 40 mg/kg组PI、hTERT 蛋白阳性率均较自然恢复组低，差异有显著性（P<0.01或P<0.05）。结论 维A酸可能是通过抑制端粒酶及细胞增殖活性，发挥逆转胃癌前病变的作用。Abstract:Objective To observe the effect of retinoic acid（RA） on proliferating cell nuclear antigen (PCNA, represented with proliferating index, PI) and telomerase activity (represented with human telomerase reverse transcriptase，hTERT) in rats with gastric precancerous lesion． Methods The model was established by MNNG together with other factors including 15% 56 ℃ brine，sodium deoxycholate， 40% alcohol stimulus， 0.03% ranitidine， undue hunger，and overeating． PCNA(converted to PI) and hTERT was detected by immunohistochemical method， in normal group， spontaneous recovery group，and RA（20 mg/kg and 40 mg/kg） group．Results PI and hTERT of normal group and RA 40mg/kg groups were lower detected than spontaneous recovery group and was significantly different (P<0.01 or P<0.05)． Conclusion RA makes GPL reversed in rates by inhibiting activity of telomerase and cell proliferating．
Key words: retinoic acid； precancerous lesions； proliferating cell nuclear antigen；telomerase
利用某些化学物质诱导肿瘤细胞分化为正常细胞或近似正常细胞，已成为抗肿瘤药物研究的热点，维A酸是肿瘤分化诱导剂的代表之一。维A酸对多种化学致癌过程和诱癌作用有抑制作用，具有逆转胃癌前病变大鼠的肠化生和不典型增生作用，对急性早幼白血病M 型的疗效，已被证实和公认［1，2］。为进一步探讨其作用机理，本文观察维A酸对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原和端粒酶活性的影响，报告如下。
1 材料
1.1 实验动物SPF级，雄性 Wistar大鼠，6周龄， 体质量100～120 g,由湖北省实验动物研究中心提供 ,生产许可证号：SCXK（鄂）2003-0005。
1.2 主要药品及试剂维A酸( RA) ，上海第六制药厂；甲硝基亚硝基胍（MNNG）为 Fluka 公司产品；脱氧胆酸钠 ，北京双旋微生物培养基制品厂；雷尼替丁， 杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司；无水乙醇 ，上海振新兴化工一厂；氯化钠 ，天津化学试剂三厂；即用型PCNA 单抗、即用型端粒酶催化活性亚单位（hTERT）多抗试剂盒、SPDAB 即用型显色试剂盒均购自北京中山生物技术公司。
1.3 主要仪器CUT 5062轮转切片机，德国SLEE公司；BX 40系统显微镜，日本OLYMPUS公司；HPIAS1000 型显微摄像全自动图像分析仪，同济千屏影像工程公司。
2 方法
2.1 造模及给药方法按综合法复制模型 ［ 3］。大鼠50只，随机抽取 11只作为正常对照组，其余 39只用于造模。正常对照组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用 100 μg/mL MNNG 液（新鲜配制，饮水瓶用油漆涂黑避光），上午用 56 ℃、 ρ=15%的氯化钠液 10 mL/kg 灌胃。摄食为含ρ= 0.03%雷尼替丁的纯鼠饲料，饥饱相间，进食2 d的当天下午，用 ρ=0.85%脱氧胆酸钠溶液按10 mL/kg 灌胃；禁食1 d的当天下午，用 φ=40％乙醇10 mL/kg 灌胃，持续6个月(造模过程中死亡6只大鼠)。6个月末时，取正常和造模大鼠各1只杀检，观察组织病理学变化，确认模型是否成功。模型成功后，将造模存活的大鼠，随机分为：自然恢复组12只、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组各10只。
正常对照组和自然恢复组大鼠给蒸馏水10 mL/kg； RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg组大鼠分别给0.2% RA和 0.4% RA 10 mL/kg灌胃，每日1次，连续3个月(自然恢复组大鼠死亡 4只)。末次给药后，所有动物禁食1 d，放血处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，Φ=4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片 5 μｍ，免疫组织化学染色。
2.2 检测方法免疫组织化学用 SP法，按试剂说明书操作，DAB 显色，PBS 代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色阳性信号为棕色，PCNA 阳性物质定位于细胞核， hTERT 阳性物质定位于细胞质。采用显微摄像计算机图像分析系统，每张切片检测5个视野（×400）。计算PCNA阳性细胞数以及腺上皮细胞总数（每例≥200 个），求出细胞增殖指数（PI）， PI=PCNA 阳性细胞数/腺上皮细胞总数×100%。hTERT：无阳性细胞或阳性细胞数<25%为（-），阳性细胞数25％～50%为（＋），阳性细胞数 50％～75%为（＋＋），阳性细胞数>75%为（＋＋＋）。
2.3 统计学处理PI 值的比较，采用t检验； hTERT 蛋白表达阳性率的比较，采用χ2检验（校正χ2值计算），以P<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 维A酸对胃黏膜细胞增殖指数的影响 正常大鼠胃黏膜增生带细胞可见 PCNA 阳性细胞； 自然恢复组大鼠胃黏膜细胞增殖指数明显高于正常对照组和维A酸各组， 差异有非常显著性（P<0.01）；维A酸组高于正常对照组，提示维A酸有一定的抑制胃黏膜细胞增殖活性作用，见表 1。
表1 维A酸对胃黏膜细胞增殖指数的影响（略）
Tab.1 Effect of RA on PI of the gastric mucosa
与自然恢复组比较： *P<0.01；与正常对照组比较： ▲P<0.01 ( t检验 )
3.2 维A酸对胃黏膜细胞hTERT 蛋白表达阳性率的影响 正常大鼠胃黏膜没有hTERT 蛋白表达。自然恢复组大鼠8例均呈阳性表达，阳性率达100％。维A酸20 mg/kg和40 mg/kg组 hTERT 蛋白阳性率分别为60%和40% ,较自然恢复组低，见表 2。
表2 维A酸对胃黏膜细胞hTERT 蛋白表达阳性率的影响（略）
Tab.2 Effect of RA on hTERT positive rate of the gastric mucosa
与自然恢复组比较：*P<0.05;**P<0.01；与正常组比较：▲P<0.05(χ2检验)
4 讨论
增殖细胞核抗原（PCNA）是目前被公认的能较好地判断细胞增殖状态的一项指标［ 4］。
PCNA又称周期数，是存在于细胞核内的一种周期蛋白。研究表明，在胃癌前病变阶段已存在PCNA的表达异常，推论胃黏膜发生癌变的机制之一，可能是某些致癌因素引起持续的胃黏膜细胞增殖过度。
端粒酶活化是细胞保持持续分裂增殖的基础，与细胞的异常增殖密切相关，是肿瘤发生学上的一个共同途径，在肿瘤的发生发展中起非常重要的作用［5］。端粒酶是一种逆转录酶，至少由3个亚单位组成，即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白Ⅰ和端粒酶催化活性亚单位（hTERT），但仅 hTERT 水平与细胞端粒酶活性呈正相关［6］。
研究发现由胃黏膜正常细胞→胃癌前病变→胃癌的过程中，端粒酶逐渐被激活［7］，
而且其阳性率、活性水平相应地逐渐增高；也有研究发现端粒酶阳性的胃癌或癌前病变细胞增殖活性（PCNA）明显高于阴性者［8］，
均说明端粒酶的激活在胃黏膜癌变形成、发展中扮演重要角色。
本实验模拟临床发病原因，采用多因素建立胃癌前病变大鼠模型，侧重维A酸对其逆转作用机理研究。结果显示：正常大鼠胃黏膜增殖带可见PCNA 阳性细胞，但没有hTERT 活性表达，自然恢复组大鼠 PI明显高于正常组，hTERT蛋白阳性表达率 100%，表明在胃癌前病变阶段，由于各种因子的刺激而导致了端粒酶被激活和细胞增殖活性增加，使部分细胞逃脱死亡危象，并出现永生化或恶性增殖。
模型动物应用维A酸治疗 3个月后，大鼠胃黏膜 PI和hTERT 蛋白的表达显著降低，表明维A酸对其端粒酶活性和细胞增殖活性有一定的抑制作用。由此推论维A酸逆转大鼠胃癌前病变的机制之一，可能与其抑制了大鼠胃癌前病变PCNA和端粒酶活性，从而抑制胃黏膜恶性增殖，增加细胞稳定性，恢复细胞增殖和凋亡平衡有关。
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