宫颈癌多阶段多途径演进的树模型构建论文
目的 基于宫颈癌比较基因组杂交资料构建宫颈癌的树模型，探讨宫颈癌发展演进的多途径模式。 方法 根据收集的58例宫颈癌完整比较基因组杂交资料，利用Desper等建立的肿瘤树模型软件平台，构建宫颈癌的树模型。 结果 宫颈癌树模型提示，有6个非随机的染色体扩增或者缺失事件发生在宫颈癌变过程中：+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p，其中+3q和+1q可能是宫颈癌癌变中的重要早期事件；+3q要先于+17q发生，并且两者之间可能存在先后依存关系；而且，+1q可能是一个相对独立发生的事件；这些扩增染色体上可能存在与宫颈癌发生、发展演进密切相关的瘤基因。结论 基于比较基因组杂交资料构建的宫颈癌树模型，提示宫颈癌多阶段、多途径的发展演进模式，也为后续宫颈癌相关基因的探索指明了方向。Abstract:Objective Based on CGH(comparative genomic hybridization, CGH) data, to construct tree model of cervical carcinoma and to explore multipathway model of cervical carcinoma progression. Methods Using the software which Desper et al developed, tree models of cervical carcinoma were constructed according to the CGH data of 58 cervical carcinoma patients. Results Tree models for cervical carcinoma suggested that there were +1q，+3q，+5p，+17q，+20q and +20p six nonrandom genetic events, and +1q and +3q might be important early events in cervical carcinogenesis, indicating that there might be cancer?related genes in these chromosomal arms. As changes of +3q occurred prior to those of +17q, there might be some cause?effect relationship. The changes of +1q might be a independent genetic event. Conclusion Tree models based on CGH data of cervical carcinoma imply its’ multistep and multipathway progression and direct how to searching for cervical cancer?related genes.
Key words:cervical carcinoma; comparative genomic hybridization;tree model
肿瘤的发生发展是基因改变不断发生、不断累积的结果。那么，在肿瘤发生发展过程中，基因改变的模式如何呢？1988年，Vogelstein等［1］首次提出了结直肠癌演进的经典模型，即结直肠癌的演进由4个遗传事件以链式模式发展的，即路径模型：染色体5q上APC基因的缺失或突变；12p上K?ras基因的突变；18q上DCC基因的缺失；17p上p53基因的缺失或突变。第一个事件的发生能增加第二个事件发生的概率，第二个事件的发生能增加第三个事件发生的概率，依次类推。这些基因改变一旦发生，就是一个不可逆的发展演进过程。肿瘤演进的经典路径模型对于确定肿瘤早期诊断或治疗的相关基因位点具有重要价值。于是，人们试图在其他肿瘤的演进过程中找到与结直肠癌类似的路径模型，但是，都没有成功［2］。事实上，在肿瘤的发展演进过程中，遗传物质的改变不会总是按照一定的顺序、沿着一条路径发生，而且，即使在临床上或者病理学上认为同质的肿瘤，其本身存在异质性［3］。因此，探索不依赖于单纯线性演进的肿瘤发展模型是很有必要的。Desper等［4,5］提出了反应肿瘤异质性的.肿瘤发生发展的两种进化树模型，即分枝树和距离树。为此，本研究利用Desper等基于比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）资料建立的树模型软件并加以改进，对58例宫颈癌患者（其中包括4种宫颈癌细胞株）的CGH资料进行了分析，构建了宫颈癌发展演进的树模型。
1 材料与方法
1.1 材料
收集了58例宫颈癌完整CGH检测资料，其中FIGO分期Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例，还有4种宫颈癌细胞株的CGH资料［6-9］。
1.2 事件的选择
CGH检测的结果是一个关于染色体拷贝数量改变（copy number aberrations,CNAs）的遗传事件集。本文利用最常用的Brodeur法［10］选择一组非随机事件，Brodeur法假设扩增和丢失的机会均等，并与染色体臂长成正比［11］。构建树模型的数据是一系列的染色体扩增和丢失，一例病人对应一行数据，记录的是染色体臂水平扩增和丢失。人类有22对常染色体和X、Y两条性染色体，所有染色体都有长臂q，而13、14、15、21、22号染色体短臂p很短，本文排除了这5个染色体短臂，还忽略了1p、16p、19p、19q和22q这5个染色体臂，因为这些区域富含胞嘧啶和鸟嘌呤，易出现假阳性；另外，还忽略了Y染色体，因为其短且很少改变。这样就剩下36条染色体臂需要分析，而每条染色体臂都有可能扩增或丢失，因此，总共有72个可能事件。
1.3 树模型
1.3.1 分枝树（branching trees）
Desper等人［4］利用基于计算机技术的最大权重分枝方法提出的一种重构肿瘤发生发展的树模型方法，并称这种树模型为分枝树。该模型把一个节点作为根（root），而其他的每个节点都代表一个遗传事件。在一个树枝上，i>j表示一种假说的因果关系，即事件i的出现使得事件j的发生更为可能。分枝树实际上是Vogelstein路径模型的泛化，也就是将肿瘤发生的一条路径模型转化为多条路径模型（multiple pathways），一个树干即为一条路径，更直观地体现了肿瘤的异质性。分枝树提示：（1）靠近树根的事件可能是早期事件，也可能是因为与其他事件的发生相关性不大而置于近根部；（2）在一个树枝（edge）上按顺序走向的事件有可能存在因果关系；（3）集聚在树的分枝（subtree）下的事件可以作为肿瘤亚型（subclass）的标志。
1.3.2 距离树（distance?based trees）
Desper等人［5］利用现有的系统发育算法建立另一种树模型。该模型把所有的事件都作为叶子，同时把隐含的、未命名的事件作为内在节点。该模型的另一个不同点是，树中的每一个树枝都有长度，因此，基于这种方法建立的树模型被称作距离树。从根到其他事件i的距离为?log (pi), 其中pi是事件i的观察概率，可见，事件i的观察概率越大，它离树根的距离越近，即越早发生。距离树提示：（1）靠近根的事件是早期事件；（2）集聚在树的分枝（subtree）下的事件可以作为肿瘤的亚型（subclass）标志。
1.4 统计学分析
用SPSS10.0 for windows统计软件包进行χ2检验， 当n<40 或频数<1 时，用确切概率法。
2 结 果
2.1 宫颈癌发展演进树模型的构建
宫颈癌树模型见图1。从分枝树模型可以看出，+1q和+3q可能是宫颈癌癌变较早期事件，+1q是相对较独立的事件，+3q的出现可能导致+17q的发生，而+17q的发生又将促进+20q的发生，+20q的发生必将增加+5p、+20p出现的概率。从距离树可以清楚地得出+3q是宫颈癌发生发展过程中较重要的早期事件。
2.2 宫颈癌中非随机染色体事件的统计分析
58例宫颈癌（其中4个细胞株）样本中，+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p分布见表2，各染色体臂改变的频率如下：+1q为36.2%；+3q为70.7%；+5p为20.0%；+17q为24.1%；+20q为15.5%；+20p为15.5%。表1 宫颈癌6个非随机染色体事件分布情况（略）
2.3 根据宫颈癌树模型可以看出，宫颈癌可能存在2种亚型：一种以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q为标记，一种以+1q为标记；宫颈癌染色体改变以扩增为主。
3 讨 论
自从1988年Vogelstein 等［1］提出结直肠癌发生、发展、演进的经典路径模型，科学研究者们希望其他肿瘤的发展演进也有与结直肠癌相似的经典路径模式，但是都没有取得理想的结果。原因是肿瘤是一个多因素参与、多基因改变、多步骤发展的复杂过程，肿瘤具有异质性。
比较基因组杂交技术可以在染色体或染色体亚区水平上对DNA序列拷贝数进行检测、定位。它最大的优点是一次杂交就可以全面检测出肿瘤基因组复杂的遗传改变，包括染色体区段拷贝数的增加或减少。为了深入挖掘从大量标本获得的海量CGH资料中蕴含的关于肿瘤发生、发展、演进的规律，Desper等根据数学原理结合计算机技术开发出了一种CGH资料数据分析软件，即根据CGH资料数据构建肿瘤发生、发展、演进的2种树模型：分枝树和距离数。他们利用CGH资料数据分析软件分析了116例肾透明细胞癌的CGH资料，并构建了肾透明细胞癌的2种树模型，结果分析与以前细胞遗传学研究的结果相吻合，如3p丢失是肾透明细胞癌发生的早期事件，根据树模型还提出了肾透明细胞癌发生发展过程中有意义的新假说［12］。这有力地说明构建基于CGH资料的肿瘤树模型对于研究肿瘤发生发展及其演进规律是非常有意义的。
尹志华［13］等利用CGH资料数据分析软件分析了收集到的127例结直肠癌的CGH资料，构建了结直肠癌发生发展的树模型，结果显示，树模型与Vogelstein的经典路径模型有一定的吻合度，如-18q先于-17p发生，而且使后者的发生可能性更大。两者差别也是明显的，与经典路径模型相比，树模型更体现了肿瘤的异质性及肿瘤发生发展的多途径模式，更符合现代关于肿瘤发生发展演进的理论，经典路径模型显得过于简单。
本研究利用CGH资料数据分析软件分析了58例宫颈癌CGH资料，构建了宫颈癌发生发展的树模型，模型各染色体臂改变的频率如下：+1q为36.2%；+3q为70.7%；+5p为20.0%；+17q为24.1%；+20q为15.5%；+20p为15.5%。Lazo等［14］研究发现，90%的浸润宫颈癌中发现有3q的扩增。Wilting等［15］研究发现，在宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌中常见20q拷贝数的扩增。树模型提示，+1q和+3q可能是宫颈癌癌变较早期事件，统计分析结果也证明了这一点，+1q 、+3q和+17q在宫颈癌的发展演进过程的各个阶段中差异没有显着性（P＞0.05）。
Andersson等［16］研究发现，宫颈腺癌中，3q26上人端粒酶基因TERC常见扩增，并可作为宫颈腺癌的诊断指标。+5p和+20p在宫颈癌早期和进展期中，差异有显着性（P＜0.05），进展期高于早期，说明+5p和+20p 是宫颈癌发展演进的晚期事件，+20q 在宫颈癌发展演进中的确切作用有待扩大样本进一步确定。根据树模型可以推测，宫颈癌可能存在2种亚型：一种以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q为标记，一种以+1q为标记；宫颈癌染色体改变以扩增为主。
总之，利用CGH资料数据分析软件构建基于CGH资料的肿瘤发生发展的树模型，对于挖掘蕴含在海量数据中的肿瘤发生发展演进规律具有重要意义。本研究提示+1q 、+3q、 +5p、+17q、+20p和+20q是宫颈癌发生发展演进过程中的非随机事件，提示在这些染色体臂上可能存在与宫颈癌发生发展密切相关的肿瘤基因，为后续相关研究指明了方向。
由于CGH技术存在敏感性低的缺点，小于10 Mb的染色体改变检测不出［17］ ，一些染色体缺失11q23，2p, 3p, 18q21.3 和11p15.5等未出现在树模型中［18，19］。 但是，一次实验就能给出了一个肿瘤全基因组水平的遗传改变的全貌。基于CGH资料和数学模拟建立的肿瘤发生发展的进化树模型，科学地阐明了肿瘤发生发展的多基因、多步骤的演进过程，体现了肿瘤内在的异质性。深入分析宫颈癌进化树模型中的6个非随机染色体事件，对于发现与宫颈癌发生发展密切相关的肿瘤相关基因，阐明宫颈癌发病的分子机制等具有重要指导意义。
致谢：衷心感谢美国国立健康研究所（NIH）的Desper R和Schaffer A为本分析CGH资料所提供的热情帮助。
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