不同血管段活性差异对葛根素血管舒张作用机制的影响
摘要：研究离体血管环试验中不同血管段活性差异对葛根素(Puerarin，Pue)的舒张作用差异并探讨其机制。方法：SD大鼠36只，常规方法制备离体血管环标本，分为内皮完整组和内皮组两大组，其中每组都设有远心段、中段和近心段三组。用离体血管灌流大鼠胸主动脉环，血管基础张力定为9.8×10-3 N(1 g)，测定各组血管环张力及葛根素pEC50。内皮完整组分别加入L-NAME与葛根素(浴槽终浓度为10-4 mol•L-1)共同孵育，测定血管环张力变化，并计算pEC50。结果：葛根素在10-7～10-4 mol•L-1范围内对腹主动脉具有剂量依赖性的舒血管效应，在10-4 mol•L-1达到(61.2±3.7)%的最大舒张;去内皮后其舒血管效应可降低(34.6±6.1)%，比较差异有统计学意义(P<0.05);远心段去内皮及内皮完整血管环Emax均较近心段和中段比较差异有统计学意义(P<0.01);内皮完整远心段组中，葛根素与L-硝基精氨酸(L-NAME)共同孵育后，Emax显著下降(P<0.05);而近心段和中段组中，L-NAME与葛根素共同孵育组血管舒张的受抑制程度与葛根素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组pEC50比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：葛根素具有内皮依赖性的舒血管效应，但不同血管段中舒张活性存在差异，该作用与NO系统有关。
关键词：葛根素;胸主动脉环;NO合成酶;血管舒张
葛根素(Puerarin，Pue)具有扩血管、降血压、抗心肌缺血等作用。以往研究表明葛根素扩血管机制存在争议，可能与实验条件和动物种属不同有关。本文的研究旨针对血管条的不同血管段血管活性不同对于葛根素血管舒张作用机制的影响，应用NO合酶抑制剂L-硝基精氨酸(L-NAME)，探讨葛根素对不同胸主动脉段的舒张作用与NO的关系，观察葛根素的舒血管作用机制。
1 资料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物：SD大鼠36只，体重250～300 g，雌雄兼用，由青龙山动物中心提供。
1.1.2 药品：重酒石酸去甲肾上腺素(Noradrenaline Bitartrate，NA)购自天津金耀氨基酸有限公司，批号：0803192;苯肾上腺素(Phe)，L-硝基精氨酸(L-NAME)购自Fluka，批号：1115878、40705093;氯化乙酰胆碱(Ach)购自Alfa Aesar公司，批号：10132497;葛根素，由南京师范大学袁生教授实验室提供;溶于50%丙二醇进行实验。
1.1.3 试剂：K-H液：NaCl 118.0 mM，KCl 4.7 mM，NaHCO3 25.0 mM，KH2PO4 1.2 mM，MgSO4 1.2 mM，CaCl2 2.5 mM，glucose 11.0 mM。均为普通国产分析纯。
1.1.4 仪器：MD 2 000生物信号采集系统购自南京医科大学。
1.2 实验方法
1.2.1 不同种属动物胸主动脉环制备：20%乌拉坦(给药计量1 g/kg)麻醉，给药量为0.6 ml/100 g。取正常大鼠胸主动脉，置于预冷以100% O2饱和的K-H液中，去除血管周围结缔组织，制备成3～4 mm的血管环，并悬挂于盛有预先以95% CO2混合气体的K-H液的5 ml浴皿中，下段用钢丝钩固定住，上段与张力换能器相连，用MD 2 000生物信号采集系统记录张力Emax。浴皿中持续通入气体，保持(37±0.5)的恒温，给予不同前负荷，15 min换1次缓冲液，平衡60 min，加入NA(浴槽终浓度10-6 mol·L-1)预收缩2次，用K-H液洗脱至基线后进行下列实验。去内皮组以机械法去除内皮。血管内皮活性的检验：用Phe(浴槽终浓度10-6 mol·L-1)处理动脉环使其收缩至平台，加入Ach(浴槽终浓度10-5 mol·L-1)动脉环舒张至平台，检验内皮完整性，舒张活性>70%为内皮完整;舒张活性<20%则认为内皮去除。
1.2.2 葛根素对苯肾上腺素引起的收缩的影响：随机选取大鼠胸主动脉环，分为去内皮组、内皮完整组、溶剂对照及正常对照组，葛根素用Phe(浴槽终浓度10-6 mol·L-1)处理动脉环使其收缩至平台，加入葛根素(浴槽终浓度10-7～10-4 mol·L-1)动脉环舒张至平台，记算舒张百分数。
1.2.3 胸主动脉环的区域差异性：将大鼠的胸主动脉从近心段开始剪成6段，编号1～6，取1、3、6分为作为近心段、中段和远心段，进行实验[1]。分为去内皮组和内皮完整组。两组动脉环分别经预处理后，使溶液中累加苯肾上腺素的浓度依次(10-9～10-5 mol·L-1)，测定Phe引起大鼠胸主动脉条收缩的改变。后用K-H液洗3次，待主动脉条张力恢复正常并平衡45 min后，加入，孵育20 min后重复以上过程;或用L-NAME(浴槽终浓度10μmol·L-1)和葛根素(引起最大舒张百分数的浓度)共同孵育20 min后，重复以上实验。
2 结果
葛根素最大舒张浓度：结果如图1所示，葛根素引起最大舒张的浓度为10-4 mol·L-1，去内皮组和内皮完整组的最大舒张百分数为(40.2±7.78)%和(61.2±3.87)%，与溶剂及正常对照组相比，比较差异有统计学意义(P<0.01);葛根素对去内皮组与内皮完整组的舒张作用比较差异有统计学意义(P<0.05)，去内皮组明显舒张作用下降;溶剂与正常对照组相比，比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明其对体外血管环无影响。
3 讨论
体外血管环实验作为筛选心血管活性化合物及研究心血管活性物质的作用机制常用的基础实验被广泛应用，但同时由于不同种属动物不同部位的血管作用仍存在差异，并且操作规范因人而异，从而相同化合物可能得到不同结果。而葛根素舒张血管作用机制在国内外文献中就大不相同。本文着重研究了体外血管环试验中容易被忽略的因素，即远心段、中段与近心段的血管环活性差异。
早在上世纪80年代，Kita T等[2]在研究中就发现在家兔家族性高胆固醇血症模型中，远段胸主动脉的血管损伤程度要比其他段血管严重许多。而在Honda H等[1]研究中，则发现中段和远心段血管较近心段血管舒张作用的不同与乙酰胆碱诱导的内皮源性NO的释放有关。本实验中远心段血管环对于异丙肾上腺素诱导的`血管收缩活性以及葛根素诱导的血管舒张作用活性较中段和近心段血管环弱。而葛根素于L-NAME孵育后乙酰胆碱诱导的血管舒张作用均减弱，但对于远心段血管环作用最强，产生这种作用的机制可能与不同血管段合成NO能力不同有关。而中段和近心段血管在葛根素和L-NAME共同孵育后Emax虽升高，但比较差异无统计学意义，提示现有文献报道中葛根素的舒血管作用机制的争议可能与血管环样本的选择有关。但远心段血管环与中段、近心段血管环活性差异的进一步机制仍值得深入研究。