HPLC法测定益肝灵片中水飞蓟宾的含量
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【摘要】 目的 建立测定益肝灵片中水飞蓟宾含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Dikma Diamonsid C18柱，甲醇?1%冰醋酸(体积比49∶51)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长288 nm，柱温为30 ℃。结果 水飞蓟宾的质量浓度在20.68～82.72 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9;平均回收率为97.5%，RSD为2.8%。结论 本文方法简便、快速、准确可靠，可用于益肝灵片的质量控制。
【关键词】 益肝灵片;水飞蓟宾;高效液相色谱法
益肝灵片为保肝药，主要成分为水飞蓟素，属于黄酮类化合物，由水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟丁3种同分异构体组成[1]。现行国家标准采用紫外分光光度法，以水飞蓟宾计算益肝灵片中水飞蓟素的含量，测定结果是水飞蓟素(总黄酮)的含量[2]，结果受颜色变化等因素影响较大，并不能准确测定水飞蓟宾的.含量。为进一步评价益肝灵片的质量，本文建立了益肝灵片中水飞蓟宾含量测定的高效液相色谱法，并与紫外分光光度法进行比较。本文方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于该产品的质量控制。
1 仪器与试药
DIONEX高效液相色谱仪(戴安公司)，UVD170U型可变波长检测器,P680A四元梯度泵, Chromeleon化学工作站;紫外分光光度计(日立U3210);SK7200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器厂)，工作频率59 kHz，输出功率350 W。
水飞蓟宾对照品(中国药品生物制品检定所，0856-200203)，益肝灵片(广州白云山制药总厂，批号：4050001，4060001，070303，规格：38.5 mg/片)。甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为高纯水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥3 h后的水飞蓟宾对照品约10.34 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(质量浓度为206.8 μg·mL-1)。
2.1.2 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于水飞蓟宾10 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀;精密吸取上清液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照液的制备 根据处方配制阴性对照品，按“2.1.2”项方法处理得阴性对照液。
2.2 测定方法 由于水飞蓟宾对照品和供试品中都同时含有水飞蓟宾和异水飞蓟宾，因此按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟宾峰面积之和计算。
2.3 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱为Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司);流动相：甲醇?1%冰醋酸溶液(体积比49∶51);流速：1.0 mL·min-1;检测波长：288 nm ;柱温：30 ℃。分别取对照品溶液(水飞蓟宾质量浓度为12 μg·mL-1)、供试品溶液和阴性对照溶液20 μL注入色谱仪，理论板数以水飞蓟宾计算应不低于4000;水飞蓟宾的拖尾因子为0.94，保留时间约为25 min，水飞蓟宾和异水飞蓟宾与其相邻色谱峰的分离度大于1.5;阴性样品不干扰样品测定，见图1。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线的制备 分别吸取一定量的水飞蓟宾对照品贮备液，加甲醇稀释成水飞蓟宾质量浓度为20.68、31.02、41.36、51.70、62.04、82.72 μg·mL-1的溶液。依次进样20 μL，每个浓度测定3次以上。以峰面积(A)对对照品溶液质量浓度(ρ)进行回归，得水飞蓟宾回归方程为A =667.95ρ+0.11，r=0.999 9。表明水飞蓟宾质量浓度在20.68～82.72 μg·mL-1之间与峰面积线性关系良好。
2.4.2 精密度试验 取质量浓度为41.36 μg·mL-1的水飞蓟宾对照品溶液20 μL，连续测定5次，其峰面积的RSD值为2.0%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号：070303)在0、2、4、6、8、12、24 h 分别进样20 μL，记录峰面积，结果峰面积的RSD为1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.4 重复性试验 取同一批号(批号：070303)样品6份，照“2.1.2”方法处理并测定，结果水飞蓟宾平均含量为 6.45 μg·mL-1，RSD为1.5%，表明分析方法精密度良好。
2.4.5 加样回收试验 精密称取同一批号样品(批号：070303)共6份，精密加入水飞蓟宾对照品，照“2.1.2”方法处理并测定，计算回收率，结果水飞蓟宾平均回收率为97.5%，RSD为2.8%，表明本方法准确可靠，见表1。表1 水飞蓟宾回收率试验结果
2.5 样品测定
取益肝灵片3批，照“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液(12 μg·mL-1)与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算样品中水飞蓟宾的含量，结果见表2。表2 样品中水飞蓟宾测定结果
3 讨 论
3.1 最大吸收波长的选择
取对照品溶液在200～400 nm范围内进行扫描，结果在288 nm处有最大吸收，故确定检测波长为288 nm，见图2。
3.2 流动相的选择
曾试用甲醇?0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液(0.2 moL/L磷酸调节pH值4.0)[3]、甲醇?0.02%冰醋酸溶液[4]和甲醇?1%冰醋酸溶液[5]为流动相，并比较不同比例流动相对分离的影响，结果以甲醇?1%冰醋酸溶液(体积比49∶51)为流动相时的峰形较好，分离度较高。
3.3 提取时间的考察
考察超声提取10、15、20、25、30 min对提取率的影响，结果表明，超声提取20 min含量达稳定，时间增加，含量不会增加。因此选择甲醇为溶剂，超声提取20 min。
3.4 2种含量测定方法比较
理论含量根据原料水飞蓟素的含量和理论投料量计算得出。原料水飞蓟素的含量测定方法包括紫外分光光度法测定水飞蓟素(总黄酮)含量，结果以水飞蓟宾计算，不得少于68%;以及高效液相色谱法测定水飞蓟宾的含量，结果含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于30%。2种方法测定结果比较可见，紫外分光光度法测定益肝灵片中水飞蓟素以水飞蓟宾计，实际是测定总黄酮的量，结果容易受到各种因素影响而出现偏差，相比之下，采用HPLC法对益肝灵片中水飞蓟宾进行含量测定的结果更准确。见表3。表3 2种含量测定方法结果比较 批号紫外分光光度法测定含量理论含量HPLC法测定含量理论含量405000138.538.516.517.0406000142.438.517.717.607030337.338.516.816.5