鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植

时间：2022-10-05 19:21:36 自考医学专业论文我要投稿

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鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植

　　鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植

　　【摘要】目的：观察大鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植治疗肾上腺皮质功能不全的可行性，并提供一种有效的移植途径。

　　方法：成年雄性Wistar大鼠40只，分为对照组(双侧肾上腺切除术)，实验组(双侧肾上腺切除+肾被膜下细胞移植术)，假手术组(仅暴露肾脏后关闭切口)，观察大鼠体内皮质酮、醛固酮激素质量浓度的动态变化及局部新生组织的血管生长和淋巴、巨噬细胞的浸润情况。

　　结果：移植的肾上腺细胞可存活并能部分替代大鼠分泌皮质酮、醛固酮的功能。

　　术后6周局部可见血管长入，无明显炎性细胞浸润。

　　结论：植入肾被膜下的肾上腺细胞能存活并有分泌功能，且肾被膜下移植为肾上腺细胞提供良好的移植床。

　　【关键词】大鼠;肾上腺细胞;肾被膜下;异体移植

　　[Abstract]Objective： To observe the outcome of allotransplantation of adrenocortical cells in subrenal capsule in rats to treat insufficiency of adrenocortical function， and to apply an effective way of transplants.

　　Method： Cultured adrenocortical cells in vitro had transplanted into subrenal capsule with bilaterally adrenalectomized allorats， the plasma corticosterone and aldosterone level， graft survival and pathology were compared respectively.

　　Results： The transplanted adrenocortical cells could survive and partially represent functions of adrenal glomerulosa zona and fasciculate zona.

　　The plasma corticosterone and aldosterone levels were 80%、30% of sham_operated group eight weeks after operation respectively， the pale yellow tissue was visible in subrenal capsule and had been invaded by prominent blood vessels， the tissue had not been invaded by inflammatory cells.

　　Conclusion： Adrenocortical cells that have been transplanted into subrenal capsule can survive and secrete corticosterone and aldosterone， the subrenal capsule is a good position for transplantation of adrenocortical cell.

　　[Key Words]rat，adrenocortical cell，subrenal capsule，allotransplantation

　　肾上腺皮质功能减退者可用激素替代治疗，但需终身服药，剂量难以掌控，且单纯用糖皮质激素不能弥补肾上腺所有激素的短缺，特别是没有应急能力，因此，目前认为肾上腺移植仍然是治疗慢性肾上腺皮质功能减退最理想的方法[1]。

　　但由于器官来源困难及移植后的免疫排斥，其临床效果，特别是远期疗效不甚满意。

　　而肾上腺细胞移植有细胞来源丰富、可长期保存和细胞的弱免疫原性的特点，可成为治疗肾上腺皮质功能不全的理想方法。

　　本实验将体外培养的肾上腺细胞进行肾被膜下移植，为临床应用肾上腺细胞移植提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和耗材

　　成年雄性Wistar大鼠(武汉大学医学院实验动物中心提供)40只，体质量200～250g，2周龄Wistar大鼠(提供处同上)60只。

　　胶原酶Ⅰ型、DNA酶、胰蛋白酶、DMEM/F_12培养基、3_(4，5_二甲基_2_噻唑)_2，5_二苯基溴化四唑(四甲基偶氮唑蓝，MTT)、胎牛血清(Sigma公司，美国)，皮质酮酶免法试剂盒(DSL公司，美国)，醛固酮放免试剂盒(中国原子能研究院同位素研究所，中国)。

　　1.2 肾上腺细胞体外培养与移植方法

　　无菌切取2周龄大鼠的双侧肾上腺，D_Hank?s液洗涤数次后去除附于腺体表面的血迹，在无菌罩内小心剔除肾上腺周围脂肪，剪成1mm×1mm×1mm碎块，置于质量浓度1g/L　Ⅰ型胶原酶、质量浓度5mg/L DNA酶的消化液中37℃水浴振荡消化20min，待溶液呈粘糊状时加入适量含小牛血清的培养基终止消化反应，400目钢丝网过滤，收集滤液200g离心10min，弃上清液，Hank?s液、DMEM/F_12培养基依次各洗涤2次，200g离心10min收集细胞。

　　于DMEM/F_12培养基中重悬，反复吹打使细胞均匀分散呈单细胞悬液，细胞计数，调细胞浓度，锥虫蓝染色计数细胞存活率>95%，然后接种至无菌培养瓶37℃、体积分数95%的O2、体积分数5%的CO2培养，原代培养1周后进行细胞移植。

　　5_乙基_5_(1_甲基丁基)_2，4，6(1H，3H，5H)_噻啶三酮_钠盐(戊巴比妥钠溶液，质量浓度30mg/kg)腹腔麻醉，对照组(10只)行双侧肾上腺切除术，实验组(20只)行双侧肾上腺切除术+肾被膜下细胞移植：沿左肾上腺切除术的切口将肾脏外置，于左肾下极钝性分离肾被膜建立被膜下腔隙，将细胞悬液注入腔隙内，然后用钛夹关闭肾被膜，每只大鼠移植2×106个肾上腺细胞;假手术组(10只)仅暴露肾脏后关闭切口。

　　术后1周肌注激素替代治疗以减少术后死亡率，术后饮NS。

　　术后第2、4、6、8周8：00～9：00 AM内龇采血测血浆皮质酮、醛固酮质量浓度，采血后取移植体行光镜检查。

　　1.3 统计学处理

　　以±s表示，组间差异用t检验。

　　2 结果

　　2.1 肾上腺细胞分泌功能

　　对照组平均存活8.2d，术后2周血浆皮质酮、醛固酮质量浓度显著下降，术后8周实验组血浆皮质酮质量浓度约为假手术组的80%，血浆醛固酮水平恢复较慢，术后4周血浆醛固酮质量浓度仅为假手术组的10%，术后8周实验组血浆醛固酮质量浓度与假手术组比仍有统计学意义(P<0.05，表1、2)。

　　表1 血浆皮质酮质量浓度与对照组和假手术组比 1)P<0.05;与假手术组比 2)P<0.05 D表示动物已死亡或检测低于试剂盒的检测范围表2 血浆醛固酮质量浓度(与对照组和假手术组比 1)P<0.05;与假手术组比 2)P<0.05 D表示动物已死亡或检测低于试剂盒的检测范围

　　2.2 肾上腺细胞移植病理结果

　　2、4周肾被膜下镜下可见散在细胞团块附着在肾实质表面，有少许形成组织团块，肾上腺细胞呈圆形或多角形，胞体大，细胞质透明，内有许多大小规则的颗粒(图1，封2);6周肾被膜下肉眼可见黄、白色组织，与肾实质紧密相连，镜下可见血管明显从肾实质长入，且周围有连接组织与肾实质和肾被膜连接，未见炎症细胞浸润;8周见组织已被明显血管化，细胞呈条索状生长，未见炎症细胞浸润(图2，封2)。

　　3 讨论

　　肾上腺是一个实质内分泌器官，其主要功能是分泌糖皮质激素和盐皮质激素，进行细胞移植时不需要过多考虑其解剖结构的重建，仅仅需要它能分泌肌体所必需的激素即可。

　　而且与传统器官移植相比，细胞移植可以利用细胞体外扩增技术，以少量细胞扩增到细胞移植所需要的量，解决器官移植供体来源不足的难题，在低温条件下，待移植的细胞可以在体外长期保存，而待移植的器官保存时间则相对较短，并且体外培养可以改变细胞的免疫原性和抗原性，减少免疫排斥反应发生的可能或减轻免疫排斥反应发生的程度[2]。

　　本实验结果显示，实验组术后血浆皮质酮、醛固酮质量浓度逐渐上升，血浆皮质酮质量浓度术后2周与对照组比有统计学意义(P<0.05)，且血浆皮质酮质量浓度在术后8周能达到假手术组的80%(P<0.05)，说明移植细胞进入大鼠体内，移植细胞能存活，且随移植时间的延长移植细胞的功能状态逐渐恢复。

　　但血浆醛固酮的恢复较慢，术后8周也只有假手术组的30%，这与大多数报道一致。

　　可能与移植后球状带细胞逐渐丧失醛固酮分泌功能而具有皮质酮分泌功能有关[3]。

　　移植细胞的存活在很大程度上取决于移植部位。

　　肾被膜下肾上腺细胞移植满足以下几个条件：血供丰富，细胞移植成功与否关键在于移植后的第1周，血供能否建立是成败的核心[4];便于移植操作;接近肾上腺正常的解剖部位。

　　细胞移植不同于器官移植，异位移植会因为细胞所处的内环境改变而致移植细胞不能长期存活。

　　缺点是移植操作较复杂，如果能结合腹膜后腹腔镜技术，移植操作过程将大大简化。

　　本实验发现鼠肾被膜下肾上腺细胞移植能够提供其机体所必需的糖皮质激素和盐皮质激素，与参考文献[5]结果一致。

　　实验组血浆皮质酮质量浓度在术后6周明显超过术后8周的(P<0.05)，与病理结果对照可发现术后6周血管从肾实质长入移植体，可能与其分泌的糖皮质激素通过新生血管大量入血有关。

　　肾上腺皮质分泌血管内皮生长因子(VEGF)，促肾上腺皮质激素不仅调节皮质激素的合成，还在体内促进肾上腺皮质细胞分泌VEGF，可见充分的血供对肾上腺保持功能非常重要。

　　实验表明，VEGF、成纤维生长因子、转移生长因子_β、血小板衍生生长因子、血管生成素_1均参与了血管形成[6]。

　　移植细胞的免疫原性是影响移植效果的重要因素之一，一般认为移植前将细胞在适当条件下培养，可降低移植物的免疫原性，减轻排斥反应，同时肾上腺细胞分泌的糖皮质激素本身可抑制免疫排斥反应，因为大鼠肾被膜下是一个免疫特许部位。

　　本实验组在2、4周细胞团块及6周、8周带有血管的组织均没有见到明显的炎性细胞浸润。

　　证明肾被膜下也是同种异体肾被膜下肾上腺细胞移植的免疫裸区。

　　虽然肾上腺细胞移植在短短的10余年时间取得了长足的进步，但移植细胞的长期存活、功能恢复和免疫排斥难题一直困扰着人们。

　　为解决这些问题，本实验通过大鼠肾上腺细胞肾被膜下移植进行有益尝试，并找到更好的移植途径，但移植细胞功能替代及远期效果还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]ELLERKAMP V, MUSHOLT T J, KLEBS SH, et al. A murine model of allogeneic adrenocortical cell transp_lantation: Perspectives for the treatment of Addison's diease in humans[J]. Surgery, 2000, 128(6): 999-1006.

　　[2]RUTZKY L, KLOC M, BILINSKI S. Microgravity culture conditions decrease immunogenictiy but maintain excellent morphology of pancreatic islets[J]. Transplant Proc, 2001, 22(1～2): 388.

　　[3]李伟, 张孝斌, 张杰, 等. 同种异体肾上腺细胞移植[J]. 武汉大学学报(医学版), 2003, 2: 157-160.

　　[4]TUNSTEAD J R, THOMAS M, HORNSBY P J. Early events in the formation of a tissue structure from dispersed bovine adrenocortical cells following transplantation into scid mice[J]. J Mol Med, 1999, 77: 666-676.

　　[5]CIANCIO S J, KING S R, SUWA T, et al. Transplantation of normal and genetically modified adrenocortical cells[J]. Endocr Res, 2000, 26(4): 931-939.

　　[6]SOKER S, MACHADO M, ATALA A, et al. Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering[J]. World J of Urology, 2000, 18(1): 10-18.

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