烟酰胺的含量测定方法
烟酰胺的含量测定方法
摘 要：本文通过外标法用来检测烟酰胺含量值,并且在此条件下能够检测烟酰胺的最后的含量值是比较可靠的,基于此烟酰胺和烟酸得可以更好的分离,使之具有准确可靠,专属性强,稳定简便等系列特点。
关键词：外标法 烟酰胺 含量值
一、仪器与材料
1.仪器
Kromasil C18色谱柱，Agilent LC1100高效液相色谱仪,; Hypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm); ,CP225D电子天平,SHIMADZU UV2450紫外-可见分光光度计。
2.材料
烟酰胺对照品;烟酰胺;磷酸二氢钾,分甲醇,乙腈,色谱纯。
二、方法与结果
1.色谱条件
采用Agilent 110型高效液相色谱仪,Kro-masil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:磷酸二氢钾溶液(0.01mol.L-1)-水-甲醇-乙腈(1/79/15/5);流速0.8 mL.min-1;柱温:20.0℃检测波长:262nm;进样量:10μL。柱温:室温。
2.测定方法
量测定:精密称取本品约10mg,置100mL量瓶中,加水适量,振摇使溶解,用水稀释至刻度,摇匀,做为供试品溶液(100μg.L-1),精密量取10μL,照2.1项下的色谱条件,注入液相色谱仪,另取烟酰胺对照品适量,加水溶解并稀释制成含烟酰胺100μg.L-1的对照品溶液,同法测定。按外标法以峰面积计算含量。
3.线性试验
3.1精密称取烟酰胺对照品0.04055g置100mL量瓶中,加水溶解并稀释成含烟酰胺405.5μg.mL-1的浓对照品溶液,并稀释成2.028～405.5μg.mL-1的6个浓度的溶液(精密吸取浓对照品溶液1mL,分别置200mL、100mL、50mL、25mL量瓶中;精密吸取3mL、5mL,分别置25mL量瓶中,分别加水稀释至刻度),另取浓对照品溶液,形成7个浓度的溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL ,以峰面积Y对浓度X(μg.L-1)作线性回归,结果:在2.028～405.5μg.mL-1浓度范围内,测得的峰面积与与烟酰胺溶液的浓度呈良好的线性关系:Y=19.76X+3.565,r=0.9999。
即采用此法对烟酰胺进行定量分析是可行的。
4.定量限、最小检出量试验
精密称取烟酰胺对照品适量,加水溶解并稀释成含烟酰胺2.028μg.mL-1的的溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL,结果S/N=10.6,定量限为20.28ng。精密称取烟酰胺对照品适量,加水溶解并稀释成含烟酰胺0.477μg.mL-1的溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL,结果S/N=2.5,最小检出量为4.77ng。
5.系统精密度、重复性及溶液的稳定性试验
精密量取2.2.1项下的对照品溶液10μL,照2.1项下的色谱条件分别连续进样6次,以峰面积计算,结果:RSD为0.1%。取批号为080805的样品,照2.2.1项下的方法配制6份供试品溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL,以外标法计算,分别为标示量的99.4%, 99.7%, 99.5%, 99.5%,99.8%,100.5%,RSD为0.3%。取2.6重复性试验项下的.其中1份供试品溶液,室温下放置,分别于0,2,4,8,12,24,30h测定,30h内主成分峰面积的RSD分别为0.2%,表明供试品溶液在30h内基本稳定。
6.加样回收率试验
精密量取量按2.2.1项下制备的对照品溶液1,5,10mL分别置25mL量瓶中,分别精密量取按2.2.1项下制备的供试品溶液10mL加入其中,加水稀释至刻度。照2.1项下的色谱条件进样10μL,以外标法峰面积计算。结果底、中、高3个浓度的回收率分别为100.1,101.7%,103.2%,RSD为0.2%,0.2%,0.5%。平均回收率(n=9)为101.7%。
7.系统耐用性试验
保持其他色谱条件不变,只改变下述色谱条件:①流速改为1.0mL.min-1,柱温不变(20℃);②柱温设为30℃,流速为0.8mL.min-1;③更换其他品牌相同类型色谱柱。取2.1项下对照品溶液,测定主成分峰的理论板数及相邻有关物质峰与主成分峰的相对保留时间、理论板数。结果表明,在改变上述色谱条件的情况下,相邻有关物质峰与主成分峰的相对保留时间较稳定，其值约为0.8，理论板数均大于8000，分离度均大于7.0。
8.样品测定
精密称取批号为080805的样品2份,照2.2.1项下的方法制备供试品溶液;另精密称取烟酰胺对照品约10mg置100量瓶中,加水溶解并稀释制成对照品溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL,以外标法计算,测得含量为标示量的99.9%,RSD为0.2%。
三、讨论
1.检测波长的选择
精密称取烟酰胺对照品适量,分别用水和流动相溶解并稀释成20μg.L-1的溶液,分别扫描,两者的最大吸收波长均为262nm,所以选择262nm作为本法的测定波长。
2.中间体的分离效果验证
从合成工艺看,烟酰胺是由β-甲基吡啶,经空气氧化生成烟酸,与氨水作用生成β-吡啶甲酸铵,最后加热脱水生成。从药理作用看,烟酰胺作用与烟酸类似,较烟酸易于耐受;烟酸有扩张血管作用,烟酰胺无扩张血管作用。若能分离检测出烟酰胺中含有的烟酸,对控制烟酰胺药品质量具有意义。
所以选择烟酰胺有关物质中可能存在的、合成工艺中重要的中间体的烟酸,作为代表性中间体,验证本色谱条件对烟酰胺中可能存在的中间体分离效果,即称取烟酸工作对照品与烟酰胺对照品适量,加水溶解制成分别含烟酸和烟酰胺20μg.mL-1混合溶液,按照2.1的色谱条件进样,结果分离良好,烟酸与烟酰胺分离度大于10.0。
参考文献
[1]国家药典委员会编中国药典[S].2011版,二部,632.
[2]李小燕,刘淑英.HPLC法测定烟酰胺的含量[J].中国药事,2010,17(3):405.
[3]李正化.药物化学[S].第二版.北京:人民卫生出版社,2010 .
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