细胞培养在生物制药领域的应用
本文对细胞培养技术在疫苗生产、单克隆抗体制备、药物筛选、基因重组产品等生物制药领域的应用作一综述。
细胞培养在生物制药领域的应用【1】
【摘 要】经过长时间的研究与实践，细胞培养技术已经得到了充分的发展与完善，离体培养的动物细胞具有可以人为控制的培养条件且结果便于观察的特点，因而被广泛应用于生物制药领域中并对该领域产生了巨大而深远的影响。
本文对细胞培养技术在疫苗生产、单克隆抗体制备、药物筛选、基因重组产品等生物制药领域的应用作一综述。
【关键词】细胞培养 生物制药 应用
随着生命科学理论和技术的飞速发展，细胞培养技术的地位和作用日益成熟，动物细胞培养的研究取得了可观的效果，并且有着无限的应用发展前景。
主要的发展目标包括：开发生长密度高、目标产品分泌量大的细胞系;研制性能优良、吸附与解离容易、重复利用的微载体;开展规模化的生物反应器、检测系统、细胞培养与产物分离耦合系统等;设计新型培养基促进生物制品安全;研究三维细胞的培养条件[1]。
生物制药即运用生物化学、医学、微生物学等原理和方法，利用生物机体、组织、细胞、体液等生产具有预防、诊断和治疗功能的药物制品。
有关研究者采用基因重组技术或其他创新生物技术生产治疗性药物，主要产品有基因工程药物、抗体工程药物、疫苗等几类。
这些产品的开发研制及生产过程都离不开细胞培养技术。
1 疫苗生产
疫苗免疫是最有效的预防感染性疾病的措施之一。
疫苗免疫是指利用病毒性制剂、细菌性制剂及类毒素等人工主动免疫制剂，通过作用于机体的免疫防御系统起到免疫应答作用。
传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但当面临高致病性流感全球大流行、微生物感染、内毒素残余量多等问题时，传统的鸡胚生产方法可能难以满足疫苗市场的需求。
随着细胞培养技术的完善及其优点的体现积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗，未来将会越来越多依靠细胞培养技术获得理想的疫苗。
与此同时也存在一些缺陷，尤其是哺乳动物细胞培养的病毒疫苗特别适合于工业的发展，应用微载体大规模培养细胞生产流感疫苗，使得流感病毒适应传代细胞(如VERO细胞)，该细胞不仅培养条件要求不高而且遗传性状稳定，对多种病毒的感染敏感[2]，如利用生物反应器大规模进行病毒繁殖，可实现流感疫苗的规模化生产。
MDCK细胞系是被公认为最适于生产甲、乙型流感病毒疫苗的细胞系，对流感病毒增殖快、感染效率高，且不易变异[3]。
其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反应器微载体培养Vero细胞生产人用狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗。
由此可见，利用细胞培养疫苗已成为目前疫苗研制的重要应用方向。
2 单克隆抗体制备
单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
研究Hb在帕金森病中的发病机制，李旭颖等[4]制备抗Hb单克隆抗体，由重组人Hb作为抗原免疫小鼠，并将其细胞融合及细胞培养制备成杂交瘤，经过筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株，体内诱生法制备腹水经过酶联免疫吸附试验等方法进而获得特异性抗Hb单克隆抗体。
张培等[5]制备乙型脑炎病毒的单克隆抗体通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法，应用ELISA等免疫学方法进行特异性和亚型的鉴定，为快速检测方法的建立奠定了基础。
单克隆抗体药物研发已经被列入863计划和国家重点项目，国内已经有2个治疗性单抗产品准备生产，3个治疗性产品处于临床试验阶段，多个抗体药物处于临床研究阶段，已经批准的治疗性单抗有31个，目前国内正在进行临床前研究的抗体药物有：抗CEA嵌合抗体;抗破伤风抗体及抗乙型脑炎等[6]。
3 药物筛选
药物筛选是从天然或合成的化合物中筛选出高效的新药或先导化合物。
生物活性和药理作用检测所筛选出的高效的新药或先导化合物，并根据检测结果评价某一物质的药用前景，是新药研究的最初过程和关键步骤。
体外二维和应用球状聚集体、细胞片层、脱细胞基质进行三维培养肝细胞的具体技术是进行药物毒性检测的重要途径[7]。
Kostadinava等建立了一种长时间的三维肝细胞共培养体系，比单层培养肝细胞能更好地检测体内药物导致的毒性。
细胞水平的药物筛选更接近人体生理状态，外界环境干扰少，准确率高，是细胞水平药物筛选模型的核心技术高内涵筛选。
高内涵药物筛选主要在微阵列多孔板上完成，通过在微孔板上进行细胞培养，施加药物刺激进行实验操作和数据的采集和分析。
HCS技术可完成各种对于细胞生理现象本质的研究，Talyor等[8]提出高内涵概念，HCS模型主要建立在细胞水平，通过观察样品对固定或动态细胞的多个功能的作用，涉及各种不同的靶点，从多个角度分析样品的作用，最终确定样品的活性和可能的毒性。
近年来发展起来的微流控芯片技术有可能成为细胞水平药物筛选的理想选择。
Ye等[9]构建了一套用于细胞水平药物筛选研究的集成化微流控芯片系统，它可以将细胞种植、培养、标记、加药、梯度稀释等操作通过微通道网络流体控制技术集成到一张芯片完成，保持了细胞结构的完整性，可全面记录细胞对药物刺激的各种反应。
4 基因重组产品
基因工程药物是将人某一部位的基因，注入到质粒中，然后导入工程菌或工程细胞中，经细胞培养或细菌培养，充分表达扩增后，分离，纯化而得。
基因重组产品与天然型的生物学活性一致，其结构分为两种，一种与天然型的一样;另一种稍有区别，如人白细胞介素是糖蛋白质，但糖链的有无对其机能无影响，故重组的不含糖链。
哺乳动物细胞已成为生物制药最重要的表达或生产系统，FDA(美国食品药品管理局)在2000年以后批准的创新生物技术药物，用酵母表达的有2种，用大肠杆菌表达的产品只有4种，而通过动物细胞培养生产的生物技术产品则有22种，除两种组织工程产品外，其余都是蛋白类产品，这些蛋白都是分子量大、二硫键多、空间结构复杂的糖蛋白，只有使用CHO等哺乳动物细胞表达系统，这些蛋白的生产才成为可能。
建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺，赵峰等[10]取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液，分离纯化、定量计算、对纯化产品进行鉴定及检测rhIL-12的生物活性，经检测发现纯化产物回收率和纯度高，适用于工业化生产。
细胞大规模培养技术在生物制药中的应用【2】
【摘 要】动物细胞培养基是体外细胞培养的重要因素,能够影响细胞生长。
它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新的工具。
为此本文就动物细胞培养基的发展及应用进行了简要的介绍。
【关键词】生物制药;动物细胞培养;应用
一、动物细胞的特点及生长特性
动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差;②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少;④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。
二、动物细胞大规模培养技术的发展
动物细胞大规模培养技术生产大分子的生物制品起始于20世纪60年代，当时是为了满足生产疫苗的需要。
后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。
因为重组DNA技术修饰过的动物细胞能够正常地加工、折叠、糖基化、转运、组装和分泌由插入的外源基因所编码的蛋白质，而细菌系统的表达产物则常以没有活性的包含体形式存在。
随着大量永生性细胞株的创建，在商业利益的刺激下，动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来，并被应用到生产实际。
动物细胞培养主要用于生产激素、疫苗、单克隆抗体、酶、多肽等功能性蛋白质，以及皮肤、血管、心脏、大脑、肝、肾、肠等组织器官。
它在医药工业和医学工程的发展中占重要地位。
大规模动物细胞培养生产药物产品将是生物制药领域的一个很重要的方面，具有重大的经济效益和社会效益。
生物技术在过去10年有显著增长，并继续快速发展，今后几十年内还将有更多的蛋白质、抗体、多肽类药物由动物细胞培养来生产。
随着生物技术的进一步发展，开发的动物细胞生产生物制品的种类的增多及产品周期短、安全高等优点，利用动物细胞进行大规模生产生物制品凸显其优越性的发展越来越快。
三、大规模细胞培养技术的应用
近几年来，已把巨大的人力和资金投入到开发大规模细胞培养技术上，将能加快发展步伐，进一步应用遗传修饰的哺乳动物细胞生产单克隆抗体和其他精细的糖蛋白。
获得有药物作用的蛋白质是十分复杂的过程，要求分子有精确的折叠和糖基化，这些要求在细菌和酵母体内却难以得到满足。
然而，采用杂交瘤和重组DNA技术往往可以使动物细胞产生和分泌出一定数量的有用蛋白质。
大规模的动物细胞培养在药物产品的生产方面具有重大的价值。
1.疫苗
在疫苗产业早期，往往利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛来生产天花疫苗，用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗。
早在20世纪50年代，已经能够利用动物细胞培养技术生产病毒。
先在反应器中大规模培养动物细胞，待细胞长到一定密度后.接种病毒，病毒利用培养的细胞进行复制，从而生产大量的病毒。
这一突破是动物细胞工程的真正开始。
虽然动物细胞培养技术发展迅速，大大降低了实验动物的用量，提高厂生产效率，但由于原代细胞增殖能力有限，一般只能通过简单增加动物的数量来增加产量。
而使用具有无限增殖潜力的细胞系，则使疫苗的生产得到飞跃式的进展。
某些来自人体或动物体内的细胞，在一定条件下的体外培养后，可以获得无限增殖的潜力，用它们来生产疫苗可以大大降低实验动物的用量。
更为重要的是，用动物细胞体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，因为所用的细胞性质均一，经过严格的安全检验，克服了动物个体间的差异造成的疫苗质量不稳定的问题，并且大大降低了来自动物的病原体传染使用者的可能性。
用类似的细胞培养技术可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品，其先决条件是能够获得可分泌目标蛋白的细胞系。
但是，在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、成本高，因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产。
基因重组技术和杂交瘤技术大大促进了动物细胞技术的进步及其在工业领域的应用，使动物细胞大规模培养技术在生产疫苗中越来越重要。
传统上一直把细胞培养产物用于人类和牲畜的病毒疫苗，这些疫苗至今己被大规模应用。
口蹄疫疫苗是大规模动物细胞培养方法生产的主要产品之一。
1983年，英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。
美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。
2.单克隆抗体
单克隆抗体在体外诊断、体内造影、人和家畜的治疗以及工业上的应用日益广泛，需要量可达数百克。
有些系统的单克隆抗体的需要量在今后几年内将迅速增加到几公斤的数量级。
为此，迫切需要更有效的生产方法。
采用传统方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培养法)生产单克隆抗体，已不能适应实际需要。