胆酸盐与Cu2+离子相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究论
目的 研究弱酸性介质中，牛磺胆酸钠、甘牛胆酸钠、胆酸钠和脱氧胆酸钠等4种胆酸盐与Cu2+离子相互作用。方法 采用共振瑞利散射光谱。 结果 一定浓度的Cu2+离子能与胆酸盐相互作用生成络合物导致溶液RRS发生改变，并且散射强度IRRS显著增强。不同胆酸盐的反应产物具有相似的光谱特征，最大RRS波长均位于369 nm。在一定范围内，胆酸盐的浓度与散射强度（ΔIRRS）成正比。对于不同的体系其检出限在36.8～66.2 ng/mL之间。 结论 方法灵敏度高、选择性好、简便快速，可用于市售蛇胆川贝液样品中胆酸盐的测定。Abstract:Objective To study the interaction of bile salts, namely sodium taurocholate, sodium tauroglycocholate, sodium deoxycholate and cow sodium cholate, with Cu2+ in acetic acid?sodium acetate buffer. Methods Resonance Rayleigh scattering (RRS) was used to analyze the interaction. Results Bile salts could react with Cu2+ to form ion association complexes, which would result in great enhancement of RRS. The RRS peaks were similar among the four reaction products. The maximum RRS peak was at 369 nm. The intensity of ΔIRRS was directly proportional to the concentration of bale salt in a certain concentration range. Their detection limits for the four bale salts, whose order of sensitivity from high to low ranks, were between 36.8 and 66.2 ng/mL. Conclusion This method not only has high sensitivity and good selectivity, but also simple and rapid. It can be used to analyze the bale salts and serum samples with satisfactory results.
Key words:sodium taurocholate; sodium tauroglycocholate; sodium deoxycholate; sodium cholate; resonance Rayleigh scattering spectrum
胆酸盐是人和动物胆汁的主要成分，在机体中具有非常重要的生理功能。它们能调节胆固醇代谢，防止胆石生成，对脂肪的消化和吸收起着重要的作用［1］。由于一些胆盐类药物具有镇咳、祛痰、平喘、消炎抗菌等特殊的药效作用［2］，近年来胆盐类制剂已广泛应用于临床治疗。目前对胆酸盐分析，以测定市售胆酸盐制剂或胶囊中的胆酸盐含量为主，主要方法有光度法［3］ 、薄层扫描法［4,5］、高效液相色谱法［6～8］等。
共振瑞利散射（resonance rayleigh scattering， RRS）或共振光散射（resonance light scattering, RLS）是指当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射这一物理现象［9］。作为一种新的分析技术，共振瑞利散射技术已在核酸、蛋白质、肝素等生物大分子、药物、表面活性剂以及金属和非金属离子等的测定中得到越来越多的应用［10～12］。由于静电作用、疏水作用以及电荷转移作用对于RRS强度和光谱特征有重要影响，这就为通过离子缔合反应用RRS技术研究金属离子（或质子）和药物分子间的相互作用奠定了基础。对胆酸盐研究工作，近年来主要集中在胆盐胶团中胆汁酸的成分、种类及比例［13，14］，以及金属离子对胆盐胶团性质的影响［15～17］。对于胆酸盐与金属离子发生络合作用，形成金属胆汁酸络合物的报道虽已很多，但多为红外光谱、X射线粉末衍射及激光光散射光谱。我们曾采用RRS技术研究胆酸盐在酸性介质中的聚集作用 ［18］，取得良好的效果。最近，我们研究了牛磺胆酸钠(NaTC)、甘牛胆酸钠(NaTGC)、胆酸钠(牛)(NaC)及脱氧胆酸钠(NaDC)等4种胆酸盐在弱酸性条件下与Cu2+形成络合物的共振瑞利散射光谱，研究发现，4种胆酸盐与一定浓度的Cu2+均可发生络合作用，并且产生散射强度显著增强的RRS光谱，而且在一定范围内，其散射强度与胆酸盐的浓度成正比。结果表明方法简便、快速，具有极高的灵敏度，对不同胆酸盐的检出限在36.8～66.2 ng/mL之间；方法具有较好的选择性。将该法用于市售蛇胆川贝液中的胆酸盐含量的测定，结果满意。
1 仪器与试剂
Hitachi F?2500 型荧光分光光度计，测定参数，狭缝宽度10 nm，光电倍增管（PMT）负电压为400 V；pHS?3C 型酸度计（上海大中分析仪器厂）；天美UV?VIS 8500 型分光光度计（天美公司，上海）。
牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate,NaTC；华美生物工程公司）；甘牛胆酸钠（Sodium tauroglycocho?late,NaTGC；上海试剂二厂）；脱氧胆酸钠（Sodium Deoxycholate,NaDC；华美生物工程公司）；胆酸钠（牛）(Sodium Cholate,NaC；北京双旋微生物培养基制品厂)均配成500.0 μg/mL的水溶液作为储备液；CuSO4溶液，其中Cu2+的浓度为0.25 mol/L；用0.2 mol/L HAc和NaAc溶液按一定比例混合配制成不同pH值的HAc?NaAc缓冲溶液，并用酸度计校正；以上试剂都是分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
2 实验方法
依次取不同的胆酸钠溶液各2 mL分别置10 mL比色管中，分别加入适当pH值的HAc?NaAc缓冲溶液1.0 mL，然后分别加入0.5 mol/L的CuSO4溶液0.5 mL,用水稀释至刻度，摇匀，将溶液于荧光分光光度计上，以λem=λex进行同步扫描， 记录共振瑞利散射光谱， 然后在最大共振瑞利散射峰（λmax）处测量散射强度IRRS和试剂空白I0, ΔIRRS=IRRS-I0。
3 结果与讨论
3.1 共振瑞利散射光谱
图1为pH=5.0的HAc?NaAc缓冲溶液介质中4种胆酸盐的共振瑞利散射光谱图。 由图1可见，胆酸盐本身单独存在时，其RRS信号均十分微弱。Cu2+单独存在RRS信号也十分微弱，但是当在4种胆酸盐溶液中加适当浓度的Cu2+时，则因胆酸盐与Cu2+发生络合作用而使RRS显著增强，并产生新的RRS光谱。4种胆酸盐显示相似的光谱特征，其最大RRS波长均位于369 nm处。
相同测定条件下不同的胆酸盐相对RRS强度也略有不同。在pH=5.0的HAc?NaAc缓冲介质中，4种胆酸盐的相对强度顺序依次是NaTC、NaDC、NaC、NaTGC。
3.2 适宜的反应条件
3.2.1 缓冲溶液的选择及其用量的影响
比较BR（Rritton?Robinson)、HAc?NaAc、冰乙酸?乙酸铵等几种缓冲溶液对形成络合物的影响，发现4种体系均表现为在HAc?NaAc缓冲溶液中的RRS强度最大，因此选用HAc?NaAc缓冲溶液作为反应的介质。再比较不同酸度（pH 2.5～6.5）对反应体系的.影响，结果表明，在pH 4.5?6.0 的范围内络合物的散射强度最大且空白较小(如图2)，本实验选pH 5.0的缓冲溶液。缓冲溶液用量在0.50～1.5 mL之间对于体系RRS强度影响不大（见图3）。因此实验中加入HAc?NaAc缓冲溶液1.0 mL。
3.2.2 Cu2+浓度的影响
考察在369 nm处Cu2+浓度对体系ΔIRRS的影响，如图4所示。结果表明：当Cu2+浓度在0.2～0.4 mol/L的范围内，ΔIRRS最大且稳定；Cu2+浓度太低（在<0.2 mol/L时），反应不完全，强度较弱；而浓度太高（>0.4 mol/L时），RRS强度也有所下降，也不利于反应。本实验选取0.25 mol/L的Cu2+进行实验。
3.2.3 离子强度的影响
以Cu2+?NaTC体系为例，考察离子强度（以NaCl计）对ΔIRRS的影响。结果表明，当NaCl浓度范围在0.1～0.5 mol/L之间时，散射强度变化不大。
3.2.4 散射强度的稳定性
胆酸钠溶液与Cu2+溶液混合放置20 min后，其散射强度达最大，随后RRS强度一直比较稳定，至少保持12 h以上，实验选择在溶液混合0.5 h后进行测定。
3.2.5 络合物的组成
以Cu2+?NaDC为例，用等摩尔连续变化法测定络合物中Cu2+与NaDC的组成比，结果表明：Cu2+∶NaDC=1∶2,这说明络合物可能的结构为Cu ［DC］2。
3.3 反应机理探讨
胆酸盐分子一般含有羟基取代的类固醇骨架，而其尾链一般为羧基(如NaDC,NaC,NaTGC)或磺酸基(如NaTC),从结构上可分为3类：
(1)胆醇的硫酸酯：
R·OH＋HOSO3-→R·O·SO3-＋H2O
(2)胆汁酸与牛磺酸的结合物(如牛磺胆酸)：
R·COOH＋H2N·CH2·CH2·SO3- →R·CO·NH·CH2·CH2·SO3-＋H2O
(3)胆汁酸与甘氨酸的结合物(如甘牛胆酸)：
R·COOH＋H2N·CH2·COOH →R·CO·NH·CH2·COOH＋H2O
胆酸盐分子的碳氢骨架上均含有羧基氧和羟基氧，该氧原子具有一对孤对电子。而Cu2+在水溶液中以水合离子［Cu(H2O)4］2+形式存在，含有未充满d的电子层，由于Cu2+离子能提供一定的空轨道作用，所以能与含有孤对电子氧原子的胆酸盐发生络合，生成金属铜络合物。当往低浓度的胆酸盐单体溶液中引入一定浓度的Cu2+时，4种胆酸盐均可观察到RRS显著增强，并且有新的RRS的光谱峰出现，证实了以上的推断。因此Cu2+与胆酸盐分子发生络合作用，生成蓝色的金属铜络合物或螯合物，是溶液的RRS显著增强本质原因。见图5。
3.4 方法的选择性
以NaTC?Cu2+为例，比较了一些常见的离子、蛋白质、氨基酸及糖类对胆酸盐测定的影响，结果见表1。一些常见的阴阳离子如Cl-、Br-、Na+、NO3-、及烟酸、尿素、蔗糖、葡萄糖等大分子的允许量较高，但是一些金属离子Pb2+、Hg2+、Cd2+及H2PO4-、维生素B、血红蛋白和部分氨基酸的允许量较低，加入少量EDTA作掩蔽剂，可使Fe3+的允许量提高。表1 共存物质的影响(略)
3.5 散射强度与胆酸盐类药物浓度的关系
分别取不同量的胆酸钠药物于10 mL比色管中， 按实验条件操作， 并于最大波长和最佳条件下测试剂空白和配合物的RRS强度，求得ΔIRRS值，再分别以ΔIRRS对胆酸盐的浓度作图，绘制标准曲线，各体系检出限（当信噪比S/N=3时）和定量测定范围见表2。方法对4种胆酸钠药物的测定具有较高灵敏度。对不同胆酸盐的检出限在36.8～66.2 ng/mL之间。表2 标准曲线的相关系数，线性范围和检出限（略）
4 分析应用
将方法用于市售蛇胆川贝液中胆酸盐含量的测定，分析考察本法的实用性，利用标准加入法测定市售蛇胆川贝液（江西南昌桑海制药厂）中牛磺胆酸钠的含量。取10 mL蛇胆川贝液置100 mL分液漏斗中，用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，水浴蒸干，冷却后定溶于50 mL的容量瓶中，取2 mL进行测定，结果见表3。由表3可看出，方法具有较好的回收率，RSD在2.9 %～5.9 %之间，表明本法可靠，可用于胆酸盐制剂分析。表3 市售蛇胆川贝液中牛磺胆酸钠的测定结果(略)
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