金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用论文

时间：2022-10-09 02:52:51 中医学毕业论文我要投稿

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　　【摘要】目的观察银杏叶提取物金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用。方法以二甲基亚硝胺造成大鼠肝纤维化模型，分别观察金纳多与阿米洛利干预后，羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白含量的变化。结果各给药组（除阿米洛利组外）大鼠肝功能均较模型组有明显改善；阿米洛利和金纳多给药组较模型组的血清透明质酸、层粘连蛋白和肝组织羟脯氨酸含量降低(P<0.05)；肝组织内SOD较模型组升高，而MDA低于模型组(P<0.01)；金阿合用组效果最佳。结论金纳多(银杏叶提取物)与阿米洛利对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型均有预防作用，两者合用有一定的协同作用。
　　
　　目前认为，肝纤维化可以预防和逆转。近年来，已有不少学者以干扰肝纤维化形成过程中某一因素来干扰肝纤维化的发展，取得了一定成绩。由于肝脏纤维化的发生发展是一个复杂的过程，有诸多因素参与，因此仅干扰其中某一因素效果并不理想。新近关于肝纤维化形成机制的研究表明氧应激和交换泵在肝纤维化形成中起重要作用[1,2]，为抗肝纤维化的研究提供了新靶点。本实验通过建立二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型，观察联用Na+/H+交换泵抑制剂阿米洛利（Amiloride）与抗氧化剂银杏叶提取物金纳多[3]（Ginaton）联用对大鼠纤维化形成的影响，以探索临床抗肝纤维化的新途径。现将实验方法及结果报道如下。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　
　　1.1.1 动物雄性SD大鼠，体质量（180±30）g，购于湖南中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（湘2002-003）。
　　
　　1.1.2 药物阿米洛利，1 g/瓶，购自Sigma公司；金纳多(银杏叶提取物)，5 g/瓶，由德国威玛舒培大药厂生产；二甲基亚硝胺，100 mL/瓶，购于TCI公司。
　　
　　1.1.3 仪器 752-紫外分光光度计上海第三分析仪器厂，LD5-2A离心机北京仪器厂，AA-160型电子天平德国Denver公司，SN-862型放射免疫γ计数器上海分析仪器厂。
　　
　　1.1.4 试剂超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物制品公司产品；透明质酸（HA）和层粘连蛋白(LN)放免试剂盒购自上海海军生物医学研究所。
　　
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 动物分组与造模模型建立参照文献[4]。雄性SD大鼠60只，体质量150～210 g，随机分为6组，即正常组、模型组、阿米洛利组、金纳多组、金纳多+阿米洛利组（简称金阿合用组）、马络替酯组，每组10只。其中模型组及给药组每周连续3 d腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg,共3周；各给药组造模同时每日分别经胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金纳多(40 mg/kg)、金阿合用组（与单用组浓度相同），共用药3周；马络替酯组造模同时每日经灌胃马洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常对照组每周连续3 d腹腔注射生理盐水，共3周，同时每日灌胃生理盐水共3周。第4周初，摘眼球采血后处死动物，剪下完整肝脏组织标本，称肝质量后取部分中叶肝脏以10%中性甲醛固定，3 d内石蜡包埋，备病理检测；将余下肝脏于液氮中速冻，备肝组织匀浆测组织MDA、SOV、羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白，血清于-70 °C冰箱内保存备肝功能检测。
　　
　　1.2.2 肝功能、脂质过氧化指标检测 MDA、GSH-PX、 SOD HA及LN均按试剂盒说明测定。肝组织羟脯氨酸测定参照李文才等[6]的方法。
　　
　　1.3 统计学分析
　　
　　　计量资料以均数±标准差(ｘ±ｓ)表示，用统计软件SPSS10.0进行单因素变量的方差分析和最小差值显著法（LSD）的两两比较。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 一般情况
　　
　　正常对照组大鼠一般状态良好；模型组活动少，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻。各给药组大鼠精神活跃，毛发光滑，体型丰满，无腹泻。
　　
　　2.2 肝功能指标检测
　　
　　如表1所示：与正常组比较，模型组谷丙转胺酶（ALT）和碱性磷酸酶（AlP）的水平明显升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；除了阿米洛利组外，其它给药组ALT和AlP显著低于模型组，而A/G显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）；对ALT和A/G的影响金阿合用组优于阿米洛利单用组，差异有统计学意义（P<0.01）；对AlP的影响合用组优于两单用组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
　　
　　2.3 脂质过氧化指标
　　
　　由表2可见：与正常组比较，模型组MDA的水平明显升高，而SOD的活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药组不同程度明显扭转MDA和SOD，差异有统计学意义（P<0.01）；对MDA的影响金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05），对SOD的影响金阿合用组优于金纳多单用组，差异有统计学意义（P<0.05），但不优于阿米洛利单用组。见表2。
　　
　　2.4 对大鼠肝纤维化程度的影响
　　
　　由表3可见：与正常组比较，模型组HA、LN和 HYP的含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组不同程度明显降低HA、LN和HYP的含量，差异有统计学意义（P<0.05）；对HA和LN的影响，金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05）；对HYP的影响，金阿合用组并不优于单用组。见表3。
　　
　　3 讨论
　　
　　本实验的研究表明，阿米洛利与金纳多对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化具有明显的预防作用。肝功能检测提示金纳多可减轻肝细胞的变性和坏死，并改善肝细胞功能，1 mg/kg的阿米洛利无此功效，表现为除了阿米洛利组，其余各组谷丙转氨酶和碱性磷酸酶较模型组显著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比显著升高(P<0.001)。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，Hyp为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。本研究通过检测肝组织匀浆Hyp的含量发现，金纳多与阿米洛利均可降低Hyp的含量，说明阿米洛利与金纳多均可抑制胶原的生成和沉积。氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星状细胞活化的重要机制[7]。通过检测肝组织匀浆中SOD、MDA含量发现，各给药组的SOD较模型组显著升高，而MDA显著降低，说明金纳多有直接降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。而阿米洛利可能是通过抑制肝星状细胞激活、增殖及转型，从而减轻脂质过氧化的作用。对SOD、MDA的影响，合用组优于单用组，说明两者在抗脂质过氧化方面可能有协同效应。肝星状细胞活化为类肌成细胞，大量合成和分泌细胞外基质是肝纤维化形成的中心环节。本研究通过检测HA和LN的水平发现，金纳多与阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用组最低，说明金纳多与阿米洛利可以抑制肝星状细胞活化，抑制细胞外基质的合成和分泌。总之，金纳多保护肝细胞及抑制肝星状细活化的作用与阿米洛利抑制肝星状细胞活化的作用可能正是它们合用效果更佳的原因。

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