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正常绒毛和葡萄胎中Mel-CAM标记中间型滋养细胞的增殖情况论文
目的 探讨葡萄胎中Mel-CAM与滋养细胞黏附、浸润之间的关系以及Mel-CAM标记中间型滋养细胞(IT)的增殖情况。方法 采用双重免疫组化法，检测Mel-CAM标记IT的Ki-67表达情况。结果 葡萄胎中Mel-CAM表达较正常绒毛明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；葡萄胎绒毛表面有Mel-CAM标记IT出现，而正常绒毛表面则无；葡萄胎组织中IT的Ki-67指数较正常绒毛明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 葡萄胎绒毛表面有Mel-CAM表达，表现出双重分化方向，这可能与葡萄胎的发病机制有关；检测葡萄胎组织中IT的Ki-67指数对于预测葡萄胎的转归有潜在的价值。ABSTRACT: Objective To explore the relationship between Mel-CAM and adherence and invasion of trophoblastic cells and proliferation of Mel-CAM defined intermediate trophoblast. Methods Double immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of Ki-67 in Mel-CAM defined intermediate trophoblast in human villi during the first trimester and hydatidiform mole. Results In this study there was a significantly stronger expression of Mel-CAM in hydatidiform mole than that in first-trimester villi (P<0.05). The expression of Mel-CAM in hydatidiform mole was observed on the surface of villi, but not in human villi. The Ki-67 index of hydatidiform mole was higher than that it of human villi with a significant difference (P<0.05). Conclusion Mel-CAM might play an important role in the invasion of trophoblastic cells. The different differentiation type of villous trophoblast in hydatidiform mole and the first-trimester villi may be correlated with pathogenesis. The Ki-67 index of intermediate trophoblast has a potential value in predicting prognosis of hydatidiform mole.
KEY WORDS: melanoma cell adhesion molecule; intermediate trophoblast; Ki-67; hydatidiform mole
中间型滋养细胞(intermediate trophoblast, IT)是正常胎盘和妊娠滋养细胞疾病(gestational trophoblastic disease, GTD)中一类特殊的滋养细胞类型。随着研究的深入，逐渐认识到IT是一类独立的细胞类型，有自身特殊的免疫组织化学和生物学特征，并且IT的独立增生可以形成胎盘部位滋养细胞肿瘤(placental site trophoblastic tumor, PSTT)、超常胎盘部位(exaggerated placental site, EPS)、胎盘部位结节(placental site nodule, PSN)和上皮样滋养细胞肿瘤(epithelioid trophoblastic tumor, ETT)等多种良、恶性疾病。但是，由于IT的细胞形态学特征介于合体滋养细胞(syncytiotrophoblast, ST)和细胞滋养细胞(cytotrophoblast, CT)之间，给研究工作带来了极大的困难。随着IT的特异性标记物Mel-CAM的发现，使得IT的研究跨入了一个新的阶段。因此，本研究中利用Mel-CAM标记IT，研究其在正常绒毛和葡萄胎中的增殖情况，以期对IT与疾病的关系有更进一步的了解。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择1995年1月至2000年12月间西安交通大学医学院第一附属医院的葡萄胎(hydatidiform mole, HM)组织标本30例作为研究组，患者年龄22-50岁，平均32岁。选择2000年门诊正常早期妊娠(6-12周)人流术后绒毛组织标本20例作为对照组。
1.2 主要试剂
鼠抗人Mel-CAM及Ki-67单克隆抗体均为北京中山金桥生物技术有限公司产品。
1.3 标本的制备及免疫组化染色
取上述葡萄胎患者首次清宫组织标本及正常早期妊娠绒毛组织标本，多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，切片厚5 μm。用双重免疫组化的方法先进行Ki-67的染色，DAB显色；然后做Mel-CAM染色，AEC显色。阴性对照：用相邻切片对照染色，以PBS代替第一抗体作为阴性对照。阳性对照：用已知阳性绒癌组织切片做Me l-CAM的阳性对照，乳腺癌组织切片做Ki-67的阳性对照。
1.4 结果判断
①Mel-CAM标记IT的比例。每张切片观察10个高倍视野(×400)，每个高倍视野计数100个滋养细胞，计算其中Mel-CAM阳性染色细胞所占的比例。阳性细胞数<25%为阴性(-)，25%-50%为弱阳性(＋)，50%-75%为阳性(?)，>75%为强阳性(?)。②Ki-67标记指数。每张切片观察10个高倍视野(×400)，每个高倍视野计数100个中间型滋养细胞，计算其中Ki-67阳性核的IT的百分比。
1.5 统计学方法
所有资料采用SPSS13.0软件分析。资料为等级计数资料，采用Kruskal-Wallis秩和检验，双侧P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Mel-CAM的表达
Mel-CAM表达仅见于IT，表现为均匀一致的线性染色包绕于整个IT表面。ST和CT无表达，蜕膜、内膜腺体和基质炎症细胞对Mel-CAM均为阴性表达。IT的Mel-CAM染色不仅表达在单核IT中，多核IT表面也可见表达，展示了一个IT变化的系列形态(图1、图2)。这可能显示了从CT向ST转变的一个中间阶段。无论在正常绒毛还是葡萄胎组织中，所有的Mel-CAM阳性细胞的染色强度无明显差异。
在正常绒毛表面未见Mel-CAM表达，滋养细胞柱和浸润蜕膜的部分绒毛外IT中可见染色。这种染色模式在一定程度上反映了细胞滋养细胞在绒毛表面和绒毛外的不同分化途径，以及不同类型滋养细胞的生物学特点。
在葡萄胎组织的Mel-CAM阳性染色不仅出现在绒毛外IT，绒毛表面也有滋养细胞的表达(图1-图4)。葡萄胎组织中Mel-CAM染色的阳性细胞比例较正常绒毛组织染色明显增加，二者间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 Ki-67的表达
Ki-67蛋白着色部位在细胞核中，为棕黄色颗粒状，颗粒颜色深浅不一，大小各异。CT、IT及蜕膜细胞和部分淋巴细胞的细胞核均可见阳性染色，以CT的表达为主，ST中无表达。在正常绒毛中，仅有绒毛内层的部分CT 表达Ki-67，少数IT可见阳性染色，ST均为阴性。葡萄胎中绒毛内层大多数CT均对Ki-67有阳性染色，部分浸润的IT有着色，ST无表达(图1-图4)。
2.3 Mel-CAM标记IT的增殖
正常绒毛中，大部分Mel-CAM标记IT，包括多核IT，不显示Ki-67染色；而葡萄胎中Mel-CAM标记IT的Ki-67染色明显增加，绒毛表面和浸润的IT中均有表达，Ki-67标记指数见表1。与正常绒毛相比，葡萄胎组织中Mel-CAM标记IT的Ki-67标记指数水平较高，二组间差异有统计学意义(P<0.05)。表1 Ki-67在Mel-CAM标记IT中的表达（略）
3 讨论
黑素瘤细胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule, Mel-CAM)又称CD146或MUC18，是一种单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily, IGSF)的成员。Mel-CAM位于细胞膜表面，包括五个特征性的免疫球蛋白(Ig)样结构域(V-V-C2-C2-C2)，一个跨膜区和一个细胞浆内短尾，与许多细胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM)有同源性［1］。最早发现Mel-CAM在黑素瘤细胞上表达，参与细胞间及细胞-细胞外基质间黏附，在正常组织细胞间的黏附和肿瘤细胞的黏附、浸润和转移中均起到重要的作用［2］。后来发现Mel-CAM是一个高敏感和特异的IT标记物，在绒毛滋养细胞柱和绒毛外中间型滋养细胞的所有亚型中表达，而在CT和ST中则无，为IT代表滋养细胞的一个独特亚群的观点提供了更进一步的证据［3］，并且在绒毛植入、胎盘形成和滋养细胞肿瘤的浸润转移中起到重要作用。因此，在正常胚胎种植和妊娠滋养细胞疾病中得到了广泛的研究。通过我们的研究也发现，Mel-CAM表达仅限于正常绒毛和葡萄胎组织中的IT，故可作为一种标记物以区分起源于不同滋养细胞群的病变，如超常胎盘部位、胎盘部位滋养细胞肿瘤及绒癌等的鉴别诊断，为临床病理学的工作提供了很大地便利条件。
本研究中，正常早孕绒毛组织的Mel-CAM仅表达于滋养细胞柱和浸润蜕膜的绒毛外IT中，而绒毛表面的滋养细胞无表达。该结果与一些学者的研究相一致［4-5］。众所周知，胚胎植入的过程主要是依赖滋养细胞柱及绒毛外滋养细胞对子宫蜕膜的侵袭浸润完成的，说明Mel-CAM与滋养细胞的黏附浸润有关。Shih等［6］认为子宫平滑肌细胞可能表达Mel-CAM受体，该受体与IT表面上的Mel-CAM蛋白相结合，从而参与了种植过程中滋养细胞在子宫内膜和肌层内的浸润，而侵袭性较强的葡萄胎组织中Mel-CAM的表达较正常绒毛明显增加，二者间差异有统计学意义(P<0.05)，也进一步证明了Mel-CAM与滋养细胞浸润能力有关。有学者认为［2］，肿瘤细胞间Mel-CAM和Mel-CAM受体的相互作用引起了肿瘤细胞的聚集，而Mel-CAM阳性的内皮细胞则可介导肿瘤细胞贴附于血管内皮，侵入周围组织。可见，Mel-CAM在正常胚胎植入、滋养细胞的分化以及滋养细胞的黏附浸润过程中都起到了重要的作用，可以作为一个临床上预测妊娠滋养细胞疾病的侵蚀能力，判断疾病的恶性程度的辅助工具。
在正常绒毛和葡萄胎组织中，Mel-CAM的免疫染色特征相同，为IT表面均匀一致的线性染色，CT和ST均无表达。但是，二者在绒毛表面的表达模式不同。正常早孕绒毛中，Mel-CAM在绒毛表面无表达，仅见于滋养细胞柱和绒毛外滋养细胞中。这显示了正常早孕绒毛中CT的两个不同的分化方向：绒毛表面的CT直接融合为成熟的ST；而在滋养细胞柱上经过了IT这个中间过渡阶段。而葡萄胎中Mel-CAM的表达既可见于绒毛表面，也可见于浸润的IT中。这说明在葡萄胎组织绒毛表面的CT分化失调，不仅可以直接分化为ST，也可经过IT分化为ST，表现出双重分化途径。这种分化模式与葡萄胎的发病机制间有何关系还有待于进一步的研究。
Ki-67是目前国际上研究非常多的一个细胞增殖标记物。Ki-67蛋白被认为普遍存在于细胞核中，与增生密切相关，可在除G0期外的所有细胞周期中表达，具有许多细胞周期调节蛋白的特征。有学者认为它涉及了细胞周期的检查点控制机制［7］。现在Ki-67已经被广泛用于检测肿瘤组织中细胞的增生情况，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤等多种肿瘤中的表达显着增高，被认为是一个非常有价值的增殖标记物。正常早孕绒毛组织中Ki-67主要在CT中表达，而ST中则无阳性染色［8］。众所周知，正常早孕时，CT为滋养细胞的干细胞，细胞核分裂活跃，随着CT的分化，其浸润能力增高而增殖能力丧失。ST是已经分化成熟的细胞，彻底丧失了增殖能力。因此，CT中可见阳性表达，而ST内未见到阳性染色。这是与滋养细胞的生物学功能相一致的。在葡萄胎中，滋养细胞的增殖分化失控，不仅在绒毛基底部的CT中有Ki-67的表达，浸润的IT中也可见大量阳性染色。提示葡萄胎中，滋养细胞浸润能力增加的同时其增殖能力不仅没有丧失，反而有所提高，导致了疾病的发生。比较正常绒毛和葡萄胎组织中IT的Ki-67标记指数，后者明显增高，二者间差异有统计学意义。说明检测葡萄胎组织中IT的Ki-67指数对于预测葡萄胎的转归有潜在的价值。
综上所述，Mel-CAM是一个非常有价值的标记物。它的发现为研究IT在妊娠滋养细胞疾病中的作用，以及滋养细胞的黏附、浸润和转移有很大的帮助。在正常胚胎着床和妊娠滋养细胞疾病的发生发展中起到了不可替代的作用，具有广泛的应用前景。而异常增殖的IT在妊娠滋养细胞疾病的发生发展以及疾病的特征中担任了重要的角色，仍需要进一步的研究。
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