石仙桃中总黄酮的提取和含量检测
石仙桃系兰科石仙桃属植物石仙桃(Phoidotaof chinensis Lindl.)的全草，俗称石上莲、石橄榄、石穿盘等，始载于《生草药性备要》。其性甘味凉，具有养阴、清热、利湿消瘀的功效，民间常用来治疗高血压病、头晕和各种原因引起的头痛。石仙桃属植物全球约30种，中国有14种，产于南方，尤以西南地区多见。下面小编就为大家整理关于石仙桃中总黄酮的提取和含量检测的路我嫩，希望可以帮助各位生物制药的同学哦!
摘要：采用单因素试验及正交试验设计，利用乙醇溶剂浸提结合微波辅助提取法对石仙桃(Phoidotaof chinensis Lind L.)总黄酮的提取工艺进行优化，并用分光光度计比色法测定提取的总黄酮含量。结果表明，石仙桃总黄酮提取的最佳工艺条件为微波功率300 W，提取时间30 min，温度60 ℃，料液比(m∶V，g∶mL)1∶20，乙醇体积分数80%。按照最佳工艺条件进行提取，石仙桃总黄酮提取量达31.41 mg/g。
关键词：石仙桃(Phoidotaof chinensis Lind L.);总黄酮;提取工艺;含量测定;正交试验
研究表明，石仙桃主要化学成分为萜类、酚类、木脂素类、黄酮类，多糖等。目前石仙桃化学成分的定量研究主要是对挥发油等的研究，目前尚未发现对石仙桃总黄酮提取工艺的研究。为此采用微波提取法提取石仙桃总黄酮，以石仙桃总黄酮提取量为考察指标，通过单因素试验和正交试验，探究微波法提取石仙桃总黄酮的最佳工艺，旨在为石仙桃进一步研究和资源开发利用提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
石仙桃全草采自赣南;芦丁对照品由北京恒元启天化工技术研究院提供。
WF-4000C型常压微波快速反应系统(上海屹尧分析仪器有限公司);λ-35型紫外可见分光光度计(美国铂金埃尔默公司);DZF-6050型烘箱(上海一恒科技有限公司);ABl35-S型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制 称取芦丁对照品2.70 mg，用体积分数70%的乙醇溶解，10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL芦丁对照品溶液，分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞试管中，加水至5 mL，加5%亚硝酸钠0.6 mL，摇匀放置6 min，加10%硝酸铝0.6 mL，摇匀放置6 min，加4%氢氧化钠3.0 mL，摇匀， 加水至刻度，摇匀放置15 min。另取一10 mL具塞试管，不加对照品溶液，只加显色剂，按照上法制成空白对照。采用紫外可见分光光度计在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线：A=12.971 C-0.0076，r=0.999 6，A表示吸光度，C表示芦丁溶液浓度。芦丁溶液浓度C在0.010 8～0.0648 mg/mL范围内与吸光度A有良好的线性关系。
1.2.2 微波法提取石仙桃总黄酮 称取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，一定条件下提取，减压抽滤，回收滤液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待测溶液。取待测溶液5 mL， 加入15 mL 70%乙醇，摇匀，即稀释4倍。取稀释液2 mL，按“1.2.1”方法显色，制成10 mL显色液及空白对照，在510 nm下测定其吸光度A，按回归方程计算出样品溶液中的总黄酮含量(mg/mL)，根据稀释倍数及样品质量换算出样品中总黄酮的含量(mg/g)。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 微波提取功率对石仙桃总黄酮提取量的影响 称取石仙桃样品2.000 g，按液料比(V/m，下同)20∶1，乙醇体积分数70%，提取时间15 min，提取温度70 ℃，分别在功率100、200、300、400、500、600、700 W条件下提取石仙桃总黄酮，结果见图1(图中数据为3次重复的平均值，下同)。从图1可以看出，当微波功率小于300 W时，总黄酮提取量随微波功率增大而增加，当微波功率大于300 W时，总黄酮提取量随微波功率增大而减小，这主要是因为当微波功率较低时，通过吸收微波能量产生热量的极性分子吸收的能量少，产生的热量低，细胞内温度上升得慢，液态水气化产生的压力小，细胞膜的破碎度低，导致总黄酮的提取量低，随着功率的增大，细胞膜的破碎程度不断增大，总黄酮的提取量也随之增大，但细胞膜的'破碎度不可能无限增大，当微波功率继续增大时，总黄酮可能会分解，其他杂质的溶解也会增加，故后续试验微波功率选定300 W。
2.1.2 微波提取时间对石仙桃总黄酮含量的影响 称取石仙桃样品2.000 g，按微波功率300 W，液料比20∶1，乙醇体积分数70%，提取温度70 ℃，分别在时间10、15、20、25、30、35、40 min条件下提取石仙桃总黄酮，结果见图2。从图2可以看出，当提取时间低于30 min时，石仙桃总黄酮提取量随提取时间的增加而增大，当提取时间超过30 min时，石仙桃总黄酮提取量随提取时间的增加而减少。这可能是因为加热时间较短时，细胞内极性分子吸收的微波能量较少，液态水气化产生的压力较小，对细胞膜被破坏的程度较小，故总黄酮提取量不高;随着时间的延长，细胞内极性分子吸收的微波能量增加，液态水气化产生的压力增大，细胞膜被微波破坏程度加大，但时间过长，杂质的溶解也会增加，乙醇挥发量增加，总黄酮提取量下降，因此确定后续试验提取时间为30 min。
2.1.3 提取温度对石仙桃总黄酮含量的影响 称取石仙桃样品2.000 g，按微波功率300 W，提取时间30 min，液料比20∶1，乙醇体积分数70%，分别在温度40、50、60、70、80、90 ℃条件下提取石仙桃总黄酮，结果见表1。从表1可以看出，60 ℃时石仙桃总黄酮含量最高，80 ℃时石仙桃总黄酮含量次之。 2.1.4 液料比对石仙桃总黄酮含量的影响 称取石仙桃样品2.000 g，按微波功率300 W，提取时间30 min，温度60 ℃，乙醇体积分数70%，分别在液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1条件下提取石仙桃总黄酮，结果见图3。从图3可以看出，当液料比低于20∶1时，石仙桃总黄酮提取量随液料比的增加而增大，当液料比高于20∶1时，石仙桃总黄酮提取量随取液料比的增加而减少。
2.1.5 乙醇体积分数对石仙桃总黄酮含量的影响 称取石仙桃样品2.000 g，按微波功率300 W，提取时间30 min，温度60 ℃，液料比20∶1，分别在乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%条件下提取石仙桃总黄酮，结果见图4。从图4可知，当乙醇体积分数低于80%时，石仙桃总黄酮提取量随乙醇体积分数的增加而增大，当乙醇体积分数高于80%时，石仙桃总黄酮提取量随取乙醇体积分数的增加而减少。这是因为在植物中，黄酮类化合物多以苷类形式存在，黄酮苷元极性较小，糖基极性较大，根据相似相溶原理，随着乙醇体积分数的增大，部分酯溶性黄酮溶解量增加。但当乙醇体积分数较高时，水溶性黄酮的溶解度降低，并且乙醇体积分数较高会使细胞蛋白质很快凝固，不利于乙醇向细胞内渗透，溶解并释放细胞内黄酮类物质，使总黄酮提取率下降。