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环肽药物合成方法的简要
环肽药物合成方法的简要
摘要：多肽合成药物在治疗上的重要性，越来越引起广大药学工作者的重视。
根据肽链的构成可将多肽分为同聚肽(Homomeric)和杂聚肽(Heteromeric)两大类，前者完全由氨基酸组成，后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分组成的，如糖肽。
根据肽键的结构又分为直链肽和环肽。
其中直链肽的研究最为广泛和深入，尤其在直链肽的合成技术方面无论是液相法还是固相法都已成熟。
环肽药物合成的方法还存在一些问题，下面就对这些方法进行研究和探讨。
关键词：环肽 合成 方法
根据环肽的环合方式又分为首尾相连环肽、侧链和侧链相连环肽、侧链和端基相连环肽、含二硫桥的环肽、以及含有其他桥连结构的环肽。
从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。
因为环肽的前体-直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，有利于分子间缩合。
一、活泼酯法
活泼酯法中活化羧基和环合反应是分两步进行的。
活泼酯相对很稳定，一般不需要纯化可直接用于环合反应。
几乎所有可用于偶联反应的活泼酯都可用于合成环肽，主要有对硝基酚酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯和2,4,5-三氯苯酚酯。
线性多肽的C端羧基与对硝基酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚或2,4,5-三氯苯酚，在DCC或其他缩合剂存在下，于低温反应，很容易得到相应的活泼酯。
这种N端通常带有BOC或Z保护的活泼酯在酸性条件下脱去保护基，形成活泼酯的氢卤酸盐，在弱碱性稀溶液中，如在吡啶，DMF或二氧六环一类介电常数较大的溶剂中，保持pH8~9，加热(60~100°C)或室温搅拌数小时至数日，最终可得到环肽。
二、迭氮法
在多肽合成中迭氮法是另一种比较经典的方法，这种方法的优点在于很少引起消旋反应，最早用于直链肽的合成，现在常常被用于环肽的合成。
具体方法是，把直链肽的甲酯，乙酯，苄酯，取代苄酯或其它更活泼的酯通过肼解的方式生成酰肼，溶于醋酸或盐酸-醋酸混合溶液，在-5°C左右的温度下加入1M的亚硝酸钠溶液，产生的亚硝酸则与酰肼反应生成迭氮物。
N端游离的直链肽迭氮物于4°C搅拌一天再升温至室温，可得环肽。
Bodansky最早应用迭氮法合成了cyclo(D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile)，虽然上述环肽不具有其母体化合物malformin的生物活性，但合成它为应用迭氮法合成环肽开辟了前景。
应用迭氮法合成环肽的另一个成功的例子是内皮素拮抗剂的合成。
Endothelin(ET)是一种高效的血管收缩剂，由21个氨基酸残基组成，其受体拮抗剂之一cyclo(D-Trp-D-Asp(OtBu)Fmoc-Ser-D-Val-Leu)的合成过程如下：
DPPA系二苯基磷酰基迭氮化物，是一种稳定的液体，沸点157°C，用二苯基磷酰氯和NaN3在丙酮中室温反应很方便地得到，可以直接用作多肽偶联的缩合剂，近年来多用于环肽的合成。
Arg-Gly-Asp(RGD)是多种细胞外蛋白与整合素相互作用时被整合素识别的关键序列，对含有该序列环肽的合成报道很多。
Kessler等用固相合成仪SP650合成了13个含RGD序列的线性六肽和七个含RGD序列的线性五肽，N端和C端均游离的直链肽在稀溶液中以DPPA为缩合剂，保持pH8.5~9，反应4天，得到相应的环六肽和环五肽，收率在15%~50%之间。
生物活性实验表明所有的环六肽对细胞粘附的抑制作用均明显低于线性肽GRGDS。
三、固相法合成环肽
固相法能够有效地避免环合过程中二聚、多聚等副反应的发生。
早在60年代，Fridkin等就应用高分子载体来合成环肽。
线性多肽的C端羧基与树脂形成酯键而将线性肽挂在树脂上，脱去N端保护基后，以三乙胺中和，室温12小时后得到60%~80%收率的环肽，具体过程如下：
近年来发展起来的通过氨基酸侧链与树脂连接合成环肽的策略在环肽合成中应用广泛。
对具有天冬氨酸或谷氨酸残基的线性多肽，可选择这两个酸性氨基酸残基的侧链羧基为C端，与PAC(烷氧基苄醇)或PAL(烷氧基苄胺)或其他类型树脂缩合，将线性多肽挂在树脂上。
主链羧基用烯丙基保护。
逐步接肽完成之后脱去N端和C端保护基，加入缩合剂得到连在树脂上的环合产物。
最后用三氟醋酸：茴香硫醚：b-巯基乙醇：苯甲醚混合试剂从树脂上切下环肽，同时脱去其它侧链保护基。
采用这种策略完成了Cyclo(Ala-Ala-Arg-D-Phe-Pro-Glu-asp-Asn-Tyr-glu)的合成，收率为71%。
这种方法的局限性在于线性多肽前体中必需包含天冬氨酸或天冬酰氨，谷氨酸或谷氨酰胺。
四、酶法合成环肽：
在缓冲液中利用蛋白酶合成环肽也是正在发展的方法之一。
Jackson等报道了以线性多肽酯的衍生物为底物，通过酶催化成环的方法合成了几个包含12~25个氨基酸残基头尾相接的环肽，环化用的酶Subtiligase是枯草杆菌蛋白酶突变的产物，催化反应体系为pH=8的缓冲溶液。
用HPLC检测，收率在30%~80%之间。
环化效率与肽的序列和长度有关。
利用Subtiligase合成环肽所需的线性肽的最小长度是12个氨基酸残基，低于此数将得到水解产物或线性肽二聚产物。
可能是因为低于12个残基的肽底物形成的头尾相接的空间构象不能与酶的活性中心匹配。
五、合成环肽的其它方法
下面介绍几种比较特殊的环肽合成方法：
Meuterman等人巧妙地将光敏感辅助剂融合在环肽合成过程中，这种与常规合成方法不同的策略，不仅丰富了环肽合成方法学的内容，也为其他合成工作者提供了想象空间。
直链五肽H-Ala-Phe-Leu-Pro-Ala-OHH-Ala-Phe-Leu-Pro-D-Ala-OH和H-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-OH在常规条件下，溶于DMF，使成为10-3~10-4M溶液，加入3倍量Bop为缩合剂，5倍量DIEA作为碱和催化剂，未得到单体环合化合物，只得到了环二聚体和环三聚体。
采用光敏辅助剂的方法，将5-硝基-2-羟基苄基和6-硝基-2-羟基苄基以及巯基乙基等光敏结构引入线性肽N端，这些结构中的羟基或巯基与C端羧基成酯后，使得N端与C端在空间位置上更为接近，经酰基转移使环缩小而得到N端连有光敏辅助剂的环肽，最后经光解反应脱去光敏辅助剂，得到首尾相连的环五肽，收率为20%，以Cyclo(Ala-Phe-Leu-Pro-Ala)的合成为例，具体过程如下：
在传统的环肽合成方法中，不仅线性肽前体的氨基酸侧链一般都需要保护，而且要求反应物在溶液中呈高度稀释状态，非保护的氨基酸的环合无论是在概念上还是在机理上都不同于传统环合方法，主要特征是(1)酰胺键在没有活化剂存在下，通过分子内酰基转移而形成;(2)两个反应端基在缓冲液中的可逆反应造成环-链的结构互变，调节和控制环的形成。
这种非保护环肽的合成方法避免了烦琐的保护和脱保护步骤以及反应液高度稀释的要求，终产物可直接用于生物活性实验。
JameP.Tam等建立了分子内转移硫内酯化和Ag+离子辅助环合来制备非保护环肽的方法。
对于N端为半胱氨酸，C端为硫酯的线性多肽，在pH=7的磷酸缓冲液中，巯基与硫酯基生成共价的硫内酯，这种硫内酯自发地经过S原子到N原子酰基迁移而形成环肽，对于不含半胱氨酸的线性多肽的环合，采用亲硫的Ag+离子辅助配位柔性的线性多肽的N端氨基与C端硫酯形成一个环状的中间体，通过熵活化促进分子内环合。
与硫内酯环合方法原理相似，Ag+离子通过一种非经典环-链结构互变而促使分子内环合的发生。
由于环肽的前体-直链肽所包含的氨基酸的数目和种类的千差万别，造成了环肽合成方法的多样化。
对某种直链肽表现出高效，快速缩合作用的试剂和方法对另外一种肽链就可能变得低效或无效。
因此，根据目标环肽的序列寻找对应的环肽合成方法必须通过认真的探索和艰辛的努力。
参考文献：
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