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微生物培养技术初探-农业生物技术论文
论文摘要：文章简要介绍了微生物不可培养的原因，总结了培养技术中存在的问题，提出如何改良培养微生物的技术，并阐述了模拟自然环境条件、强调微生物相互关系是提高微生物可培养性的关键。
论文关键词：微生物;培养技术;环境条件;生物细胞
目前自然界中只有极少部分微生物能够得到培养，严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。因此必须改进传统培养方法，采用新型培养技术，提高微生物可培养性，大量培养自然界中存在的微生物，从而更全面、准确地了解微生物细胞的生命规律、获悉微生物群落中各种微生物之间的动态相互作用和相互协调的规律，对环境微生物工艺进行准确地设计、精细地调控和高效地利用。
一、微生物不可培养的原因
对微生物进行常规培养时，由于生活条件的改变，有些微生物不能适应而死亡，另一些则通过产生孢子进入休眠状态或改变细胞形态、进入维持一定代谢活性但不生长繁殖的“活的非可培养状态”，结果均表现为微生物的“不可培养性”。
实际上，微生物的不可培养性是由于对微生物生长条件及其规律性的认识严重不足，而采取了偏离微生物生长实际情况的培养条件所造成的，这些偏离具体可以包括以下几个方面：
(一)实验室中无法完全模拟自然界的环境条件
由于目前监测技术和手段的限制，人们对微生物生存环境和自然条件的了解尚不充分。因此，人们没有或无法完全模拟微生物的自然生存条件，而通常将培养条件进行简化：将微生物置于恒温、恒湿、黑暗等环境中;将微生物限制在“板结”的琼脂或不扰动的液体介质中;简化微生物的营养组成没有提供微生物生长繁殖所必需的某些化学物质等等。所以在自然界中可以生长繁殖的微生物，在“纯培养”中生长条件得不到满足，从而导致了微生物的不可培养性。
(二)生长缓慢的微生物被忽视
环境中很多微生物都聚集生长，当将这些微生物接种至培养基时，适合生长的微生物由于生长快而占据优势地位，它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足营养而生长受到抑制。
(三)采用高浓度的营养基质
最初对微生物的培养是在富含营养的培养基中进行的，但是由于自然界中微生物数量庞大，其可利用的营养物质极度匮乏，多数处于“岔营养”状态。常规纯培养对这种认识不允分，通常将寡营养微生物迅速置于富营养状态，微生物初期的快速生长会产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质”，该类物质快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构，导致细胞死亡，从而表现出微生物的不可培养性。
(四)环境微生物之间的相互关系被忽略
微生物相互关系繁多复杂，包括：(1)种间的偏利共生关系和互惠共生关系，两者的共性是至少一个群体提供另一些群体所需的生长因子而使微生物群体获利;(2)群体感应，这种关系被认为是通过细菌间的信息交流来调控细菌的群体行为：细胞通过感应一种胞外低分子量的信号分子来判断菌群密度和周围环境的变化，从而调节相应的细菌表达以调节细菌的群体行为。以上这两种关系都是微生物生长所必需的。由于人们目前对环境中微生物之间多数复杂的相互关系所知甚少，采用的培养技术没有将这种关系考虑在内。纯培养技术将待培养的微生物与其它微生物群体、以及生存环境人为地分离开，种间的共生关系和信息交流被阻断，微生物缺乏必需的生长因子和信号分了而死亡，表现出微生物的不可培养性。
(五)对微生物生长状况进行判断的常规标准存在的缺陷，也导致某些微生物生长不被发觉，表现为“不可培养”
例如，生存在贫营养环境中的微生物尽管能够在低浓度营养条件下生长，但是有些微生物生长速度极为缓慢，在常规设定的培养周期内(例如l周)没有长成肉眼可见的菌落就被遗弃。除此之外，还有一些寡营养微生物不会形成菌落，而是在固体培养基表面迁徙生长和扩散生长，它们形成只能显微可见的几个细胞组成的小型集合。这两种情况下，改变微生物生长的判断标准或者检测方法，就可以改变微生物的“不可培养性”。
总之，导致微生物不可培养的因素有多种，有些是因为目前技术手段的限制，有些是因为人类认识水平的不足。克服这些制约因素，就可以较好地提高微生物的可培养性。目前，提高微生物可培养性的方式可分为两大类，即改进培养措施和开发新型培养技术。
二、目前微生物培养技术存在的问题
目前通过可培养微生物的总体数量来判断微生物可培养性，进而评价微生物培养方法的优劣，然而，这项评价指标没有考虑可培养微生物的群落结构。实际上，表征微生物可培养性不仅仅要根据可培养微生物的总体数量，还要分析可培养微生物的群落结构，即可培养微生物的种类丰富度和均匀度，微生物可培养性指标应该是这3种因子的函数，即：C=f(P，R，E)，其中：
C——微生物的可培养性，反映可培养微生物的种类和数量占实际微生物总种类和数量的比例;
P——可培养微生物的细胞数(CFU/L)，即传统可培养性的涵义;
R——可培养微生物的种类丰富度，即可培养微生物的种类数目;
E——可培养微生物的种类均匀度。
E=■=■
其中：H——香农-韦纳指数;
Pi——种i的个体在可培养微生物全部个体中的数量比例。
该公式中，各因素的重要性为R>P>E，即可培养微生物的种类丰富度重要性最高。
在目前实行的几种培养方法中，模拟自然环境条件，维持微生物种群间的相互关系是提高环境中微生物可培养性的关键。因此，微生物培养技术的研究应该主要围绕在这一方面，进行深入改进和发展，例如，可考虑将环境微生物用环境介质混合培养至生长稳定阶段，然后将菌液离心过滤，用上清液作为培养基培养微生物，这些方法由于在培养过程中引入了多种微生物自然分泌的信号分子和促进复活因子，均可较好地强化微生物之间的相互关系，而克服引入单一信号分子的效果有限且操作费时费力的缺点。此外，在培养过程中结合多种培养因素、组合采取多种培养方案来取代模拟一种培养条件的方案，可以获得更多可培养的微生物、取得更高效的培养结果。
三、培养微生物技术的改良措施
(一)减少毒性物质的毒害作用
由于常规培养方法使用的高浓度营养基质不利于微生物生长，适当降低营养基质的浓度可以减弱这种不利影响，研究发现低浓度基质的培养基培养出的细菌在数量和种类上均多于高浓度基质的培养基，但营养浓度过低时反而会使培养出的微生物数量下降。实际上，营养基质浓度最好与微生物自然生长环境相近，例如，辅以少量生长因子的天然海水或土壤浸提液作为培养基可以很好地培养海洋微生物和土壤微生物。另外，多聚物只有被水解为小分子物质时才能被微生物利用。以多聚物为碳源，能有效减缓毒性氧释放的速度，避免微生物在短时间内受到高强度的毒性作用。同时，充足的氧气有时也是毒性氧产生的原因之一，减少培养环境中的氧分压可减弱毒性氧的影响。以上三种措施均可减少微生物代谢过程产生的毒性氧，但有些情况下，毒性氧来源于微生物生命活动以外的过程，例如高压灭菌。
为了减少各种过程产生的毒性氧，可向培养过程中加入具有毒性氧降解能力的物质，例如过氧化氢酶、丙酮酸钠等过氧化氢降解物和抗氧化剂二硫代二丙酸。已经证实这些物质可使某些处于VBNC状态的细菌的可培养性得到不同程度的恢复。其中内酮酸钠对微生物可培养性恢复的效果最好，只有其有稳定、成本低等优点。
(二)维持微生物间的相互作用
在培养基中加入微生物相互作用的信号分子就可简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求，例如加入酰基碳链长度各异的氦酰高丝氨酸内酯均能有效提高细菌的可培养性，而与革兰氏阴性菌多种基因调控有关的另一种信号分子cAMP比氮酰高丝氨酸内酯能够促使更多细菌得到培养。同源性分析结果表明Rpf存在于多种革兰氏阳性菌中，推测原核生物可能广泛存在该类物质，因此，可考虑加入同类型的Rpf来提高环境中微生物可培养性。
(三)其他改进措施
1.延长培养时间：对“寡营养菌”的培养，可适当延长培养时间，使其能长至肉眼可见的尺度。当然培养时间不能无限增长，因为培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高。
2.供应新型的电子供体和受体：不同微生物的代谢过程不同，因此对反应的底物要求也不尽相同。供应微生物需要的特有底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。大量的研究表明，将新颖的电子供体和受体应用到微生物培养中，能够发现未知的生理型微生物。
3.利用琼脂替代物：琼脂对某些微生物具有毒性作用，采用无害且凝结作用较好的替代物质作为培养基固化剂，可以增加微生物的可培养性。
4.分散微生物细胞：自然界中很多微生物聚集生长，形成“絮体”和“颗粒”等，致使其内部的微生物不易被培养。对“絮体”和“颗粒”进行适度的超声处理，将细胞分散再进行培养，可以使更多的微生物接触培养基而得到培养。
四、结语
总之，由于微生物群落及其生存环境的复杂性，在任何情况下试图大量培养微生物都不能仅局限于一种或几种方法，而应综合采用多种有效的方法。另一方面，还应在发展微生物培养技术的同时，结合分子生物学技术，使两种方法相辅相成，更好地提高微生物的可培养性。
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