超声照射对人胚肾细胞凋亡的影响
超声照射对人胚肾细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 了解诊断超声照射对体外培养的人胚肾(HEK?293)细胞凋亡的影响。
方法 HEK?293细胞用腹部超声探头(3.5 MHz、MI 0.8)照射0、10、20、30 min，再作Hoechst 33258染色，观察细胞凋亡的变化。
结果 超声照射10 min后，细胞凋亡率与假照组比较差异无统计学意义(P>0.05);超声照射20 min后，细胞凋亡率明显高于假照组(P<0.05)，其中以照射30 min较为显著(P<0.01)。
结论 特定剂量的超声照射可诱导人胚肾细胞凋亡增加。
【关键词】 超声;凋亡;形态学
Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK?293) cells. Methods HEK?293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0, 10, 20 and 30 min, and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group, apoptotic rate of HEK?
293 cells increased significantly after 20?min exposure (P<0.05), especially after 30?min exposure (P<0.01). However, there was no statistical difference in apoptotic rate between 10?min exposure group and control group (P>0.05).Conclusion The dose of dia?gnostic ultrasound exposure can induce the apoptosis of HEK?293 cells.
Key words:ultrasound; apoptosis; morphology
超声应用于产科，可以推算胎龄、诊断先天畸型及了解胎儿宫内发育情况，它能为胎儿、胚胎甚至正在发育成熟的卵泡提供一个清晰的图像，同时也需要更高的超声输出功率。
随着孕前卵泡检测和产前检查越来越细致和精确，超声运用的频率、时间、输出功率也在不断增加，敏感的胚胎组织及生殖细胞受到的威胁也随之加大。
人们对超声使用的安全性也越发关心。
有关产科超声的安全性，目前尚无统一定论，更无具体的辐照剂量可引起哪方面的影响这样的规律可循，孕期超声检查只能尽可能地使用最低剂量。
这使超声的产前检查安全性的遵循原则带有盲目性，或者引起因不了解超声的安全范围而滥用超声，为产前检查带来隐患。
要明确知道产前超声的安全范围还需要一个漫长的过程，本实验拟探讨超声近距离辐照对体外培养细胞凋亡形态学改变的影响，为产前超声的安全使用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂
Hoechst 33258购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，其余试剂为国产分析纯。
HEK?293细胞株由广东医学院生化教研室提供。
1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258储存液，密封避光，4℃短期保存。
1.2 仪器
MCO?15A CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)，YJ?875DA 医用净化工作台(苏州净化设备厂)，IMT?I型荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪(GE公司)。
1.3 细胞培养与处理
HEK?293细胞采用常规培养方法，无血清饥饿培养调整细胞周期一致后进行实验。
将细胞分成超声照射0 、10、20、30 min组，空白组予以假照，腹部探头产科诊断条件(3.5 MHz、MI 0.8)，介质为细胞培养液(主要成分为DMEM培养基)，辐照距离<1 cm，处理后继续培养24h后检测。
1.4 细胞染色与观察
收集处理后的细胞，PBS洗涤离心2次后取10μL细胞悬液滴于盖玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，弃去固定液，用PBS洗两遍，吸尽液体。
加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，摇床轻摇，染色10 min，弃去染色液，用荧光显微镜避光拍照，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。
1.5 结果评判
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
由两位病理学技术人员对图片进行分析对照。
1.6 凋亡百分率的计算
把载波片置于24孔板培养细胞，细胞爬片，调整周期及分组照射(方法同1.3)后培养24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，荧光显微镜观察。
计算每孔5个高倍(×400)视野平均细胞总数、凋亡细胞数，最终算出细胞凋亡百分率。
1.7 统计学处理
计量数据以(±s)表示，使用SPSS10.0统计软件进行处理，多个样本均数的比较采用单因素方差分析及q检验。
2 结果
2.1 HEK?293细胞体外培养
HEK?293体外培养成功，经传代培养后，待细胞生长疏密适中，于倒置相差显微镜下进行放大倍数为600倍拍照，光镜下HEK?293细胞的形态呈多角形，贴壁生长，细胞间有连接，细胞核圆形或椭圆形，大小约占整个细胞的1/3，核内染色质及核仁清晰，部分可见分裂相。
2.2 凋亡细胞Hoechst 33258染色的形态学变化
空白组：超声处理0 min(假照)，细胞核大小较一致，核膜完整，核内染色质呈小点状均匀分布，部分可见有丝分裂相，未见异型核，见图1。
1组：超声处理10 min，细胞核形态尚规则，核膜完整，未见异形核，但对比空白组，本组细胞核部分出现大小不一，核内染色质聚集的现象，见图2。
2组：超声处理20 min，细胞核大小不均，一部分细胞核胀大，染色质边集，一部分细胞核缩小浓染，呈小颗粒状，个别细胞核膜不完整，染色质疏松，表现为凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改变，见图3。
3组：超声处理30 min，细胞核大小不均，部分可见异形核的出现，部分细胞核内染色质浓染边集，呈小团块状，个别核膜破裂染色质疏松分布于胞质中，表现为凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改变，见图4。
图1图2图3图4
图1 空白组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);图2 超声照射10 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);
图3 超声照射20 min组细胞Hoechst 33258染色结 (×600);图4 超声照射30 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600)。
2.3 细胞凋亡率比较
详见表1。
3 讨论
细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程。
细胞凋亡的主要特点为：细胞体积小，染色质浓缩，呈块状致密染色区，DNA分子被特异性DNA内切酶在核小体间切断，核裂解，形成凋亡小体[1]。
生殖细胞、受精卵和胚胎组织中，即便是个别细胞出现异常的凋亡，都有可能对其生长发育造成影响。
因此超声对细胞凋亡的影响受到学者们的关注。
bcl?2是一种重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究证明，长时间连续超声照射可引起胎鼠肾小管上皮表1 不同剂量的.超声作用HEK?293细胞凋亡百分率的改变细胞bcl?2蛋白表达水平下降。
p53基因在诱导神经细胞凋亡时有重要的作用，赵晶等[3]研究表明，超声辐照时间和剂量的增加可引起p53基因的蛋白表达水平增加。
何明生等[4]发现，电压为10 mV条件下超声辐照K562细胞10 min以上，辐照组细胞形态变化较大，核染色质浓缩呈斑块状，并有核碎裂、凋亡小体出现。
有学者发现低频超声辐照HL?60后细胞膜空隙率增加，这可能是凋亡前的形态学改变[5]。
Lagneaux等[6]则认为低频超声效应与声化学机制有关，超声诱导的声化学冷光能触发光敏感性单态氧的产生，从而对细胞产生一个“氧化应激”，继而启动细胞凋亡反应。
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有Hoechst 33258，它能与DNA非嵌入式结合，主要结合在A?T碱基区，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光，从而对细胞核进行形态学的观察。
Hoechst 33258凋亡染色法具有直观，方便的优点，并可通过形态学的变化对其凋亡的早中晚期进行估测。
本实验用Hoechst 33258对空白组和处理组细胞染色后，经荧光显微镜观察，与凋亡形态的标准相符合，其中超声处理30 min组部分细胞核染色质高度凝聚、边缘化并产生了凋亡Ⅱb期的形态学改变，部分细胞核呈异形核，细胞核形态改变最明显，细胞凋亡比例最高(P<0.01)。
而超声处理20 min组的细胞，部分出现了凋亡Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样和Ⅱa期染色质浓缩的状态，也出现了一定数量的凋亡细胞(P<0.05)，说明超声的长时间聚焦照射可以对细胞产生一定的伤害。
从本实验结果来看，达到或超过20 min的超声照射可以引起HEK?293细胞部分凋亡及凋亡前期的形态改变。
【参考文献】
[1] Vaux D L. Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death [J]. PNAS, 1993, 90(3): 786?789.
[2] 周海燕, 段云友, 杨继庆. 彩色多普勒超声照射对中孕胎鼠肾小管上皮细胞bcl?2蛋白表达的影响[J]. 中国医学影像技术, 2004, 20 (5): 683?685.
[3] 赵晶，段云友，贾化平. 晚孕期彩超重复照射对胎鼠中枢神经P53蛋白表达及超微结构的影响[J]. 中国医学影像技术, 2005, 21(5): 1169?1171.
[4] 何明生, 曹红花, 朱念麟, 等. 超声诱导K562细胞凋亡机制的研究[J]. 中国超声医学杂志, 2006, 22(10): 724? 726.
[5] Ogawa K, Tachibana K, Uchida T, et al. High?resolution scanning electron microscopic evaluation of cell?membrane porosity by ultrasound[J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(4): 249?253.
[6] Lagneaux L, de Meulenaer E C, Delforge A, et al. Ultrasonic low?energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells[J]. Exp Hematol, 2002, 30(11): 1298?1301.
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