耐高温乳酸菌的分离与鉴定
耐高温乳酸菌的分离与鉴定【1】
【摘要】 目的：本实验从不同地方采集的青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳酸菌。
方法：通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株L1;依据伯杰氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴定;通过单因素试验和正交试验确定菌株L1的最佳发酵条件。
结果：确定其为乳杆菌属德氏乳杆菌;最佳增殖培养基组分为：玉米粉16%+麸皮5%;在α-淀粉酶(5 U/g玉米粉、90 ℃、30 min)和糖化酶(150 U/g玉米粉、55 ℃、2 h～3 h)酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度60 ℃，发酵时间36 h，pH值3.5。
结论：经过初筛、复筛获得一株耐高温菌株L1，通过糖发酵等生理生化试验、正交试验鉴定，最后确定此菌株为乳杆菌属德氏乳杆菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。
【关键词】 耐高温乳酸菌;分离;鉴定
乳酸菌(Lactobacillus)是一类能从可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸的细菌的统称[1]。
由于乳酸菌具有糖利用率高、发酵液中纯度高、副产物少，使其在乳酸工业中占有重要地位[2]。
乳酸菌在食品发酵、青贮饲料、堆肥生产、医药行业等众多领域有着广泛的应用研究[3，4]，而在众多固态发酵领域中一个难以解决的问题是固态发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。
本研究从青贮饲料、果渣、泡菜、牛奶中分离高温乳酸菌，并对其发酵条件的优化进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
乳酸菌：从上海光明乳业金山牧场提供的青贮玉米饲料、陕西海盛果汁厂提供的果渣、山东牟平安得利果汁厂提供的果渣、西安农贸市场购得的新鲜泡菜汁、上海光明乳业提供的牛奶中进行分离，将收集的样品带回实验室置于4 ℃冰箱保存备用。
标准菌株：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbbruecki) JCM 1022、嗜酸乳杆菌(Lacidophilus) ATCC 3456、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IFO 13957,由陕西微生物研究所提供。
培养基: 玉米粉麸皮发酵培养基、生化鉴定培养基。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌的分离、筛选： 固体样品青贮玉米饲料、果渣等5 g放入灭菌研钵研碎后移入其他灭菌容器内，加500 mL无菌生理盐水稀释，振荡5 min，充分混匀;液体样品牛乳取1 mL移入9 mL的灭菌生理盐水的试管中，摇匀;对新鲜的泡菜汁取1 mL移入9 mL无菌水中，摇匀;然后将上述样品按照 10倍稀释法稀释至10-5、10-6、10-7，用移液枪分别移取0.1 mL到0.5% CaCO3的MRS培养基并加焦性没食子酸的厌氧培养基上，37 ℃培养24 h～48 h，形成菌落后观察其形态，挑取周围有溶钙圈的菌落。
在MRS平板上反复划线直到得到单菌落;将上述分离的乳酸菌进行革兰氏染色形态观察，淘汰革兰氏染色阴性的菌株，保留革兰氏染色阳性的菌株;同时做接触酶试验，最后保留接触酶试验阴性的菌株。
综上结果，将菌落周围有溶钙圈、革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株暂定为乳酸菌，最后将其分别转移至MRS斜面培养基上，做好标记，于4 ℃条件下保藏。
1.2.2 乳酸菌复筛：(1)最适生长温度的测定：将待测菌株活化后分别置于温度为50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的恒温箱中培养，培养24 h后测其总菌数。
(2)最适酸碱度的测定：将上述耐温能力强且菌数量较多的菌株放在适中的温度下培养，测其在不同培养时间培养液pH值的变化情况。
1.2.3 耐高温乳酸菌的鉴定： 用光学显微镜进行乳酸菌的形态学鉴定; 参照伯杰氏细菌鉴定手册及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行生理生化特性鉴定[4]。
2 结果
2.1 分离到的菌株
从不同地区采集的样品中共分离到有溶钙圈较大的、革兰氏阳性的、接触酶试验阴性的菌株共6株，显微镜下观察菌体形态，其中球菌3株，杆菌3株，分别对其进行编号，球菌记为R，杆菌为L。
2.2 优良菌株筛选结果
2.2.1 耐温能力筛选：6株菌的耐温能力见表1。
由表1得出：在各温度条件下，菌株L1、L2、R1的菌数量均多于菌株L3、R2、R3的菌数量，所以选择菌株L1、L2、R1作下一步的试验。
表1 菌株培养温度与菌数的关系
2.2.2 产酸能力筛选：将菌株L1、L2、R1在60 ℃恒温箱中培养，测其在不同培养时间培养液pH的变化情况，培养结果见表2。
通过表2可见，三株菌的产酸能力，L1菌株在20 h时，其pH值就下降到4.1，而其它两株菌产酸则较慢。
表2 菌株培养时间与pH值的关系
2.3 乳酸菌鉴定
2.3.1 形态学鉴定：菌株L1的革兰氏染色阳性，中长杆状、单个或链状;菌落形态呈灰白色、圆形、边缘完整、表面光滑、隆起。