目的 利用RNA干扰（RNAi）技术，观察脑缺血相关新蛋白KIAA0280被特异性沉默后对正常神经元和缺氧诱导神经元凋亡的影响。方法 取新生大鼠培养至5～7 d的神经元，经由密闭容器引起缺氧诱导神经元凋亡模型。采用RNAi技术封闭KIAA0280的表达，观察该基因被封闭后对正常神经元的生长以及缺氧诱导神经元凋亡的作用和影响。结果 脂质体转染KIAA0280基因特异性siRNA 12 、24 h后对正常细胞生长具有一定的影响；在此基础上缺氧4 、8 h，发现RNAi组的神经元对缺氧诱导的神经元凋亡比对照组对缺氧更加敏感，更易受损伤。结论 KIAA0280对正常神经元具有一定的作用，并且对缺氧诱导凋亡神经元具有一定的保护作用。
Abstract:Objective To observe the effect on normal neuron and apoptosis neurons induced by hypoxia after blocking the KIAA0280 by RNAi technique. Methods Primary neurons of rats cultured for 5～7 d were put to airtight container to induce neuron hypoxia and establish the model of neuronal apoptosis. After blocking the KIAA0280 by RNAi technique, the effects on the normal neuron and neuronal apoptosis induced by hypoxia were observed.Result Transfecting the specific siRNA for KIAA0280 to neuron with liposome for 12 h, 24 h, the impacts on the normal neurons by the siRNA were observed. Then, the neurons were put in hypoxia environment for 4 h and 8 h; it is found that, compared with simple hypoxic group, the RNAi group was more sensitive and liable to be injured during apoptosis induced by hypoxia. Conclusion Application of the RNAi to silence KIAA0280 had certain impacts on the normal neurons and could promote apoptosis and death in the hypoxic-induced neuron apoptosis. It was indicated that KIAA0280 had effects on the normal neurons, and played a role in protecting hypoxia-induced apoptosis neurons.
Key words: KIAA0280; RNAi; hypoxia; neuron apoptosis
缺血缺氧脑中风的病理表现为脑缺血缺氧引起神经元凋亡、坏死，进而引起脑组织的坏死。在缺氧的早期，机体会作出应激反应，主动地产生神经保护作用，使机体免受更大的伤害，使机体能耐受一定程度的缺血缺氧损伤，这种现象被称作缺血预处理（缺血预适应）［1］。脑缺血相关新蛋白KIAA0280是臧林泉等［2］人应用该缺血理论，采用mRNA荧光差异显示技术(mRNA fluorescence differential display)研究缺血时神经元在此应激条件下基因差异的表达，从中筛选出差异表达明显的基因（上调/下调基因），以明确防治脑缺血、缺氧相关疾病（心肌、器官移植、肿瘤等）的一个或者多个新靶点。前期工作利用MCAO造成大鼠缺血缺氧动物模型，免疫组织化学和Western blot 等均证实，KIAA0280在缺血缺氧组织中出现过高表达［3］，表明其与缺血缺氧所致的细胞凋亡、死亡密切相关。但是，对于其在脑组织缺血缺氧中的具体作用，目前国内外尚未见报道。本实验采用RNAi技术沉默KIAA0280的表达，以明确KIAA0280在缺氧缺血引起的神经元凋亡中的作用，为阐明脑中风、心衰、心肌梗死等与细胞凋亡相关疾病的发病机制奠定理论基础。
1 材料和仪器
1.1 动物
SPF级SD大鼠，雌性，体质量180～250 g,由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2007A006。
1.2 主要试剂 DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、优级胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、B27、HEPEs购自美国Gibco公司。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司。EDTA由Augus公司提供。Hoechst 33258、SRB由Sigma公司提供。LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯以上产品。
1.3 仪器
单人双面无菌操作台（苏州净化）， 细胞培养箱、低温高速离心机（美国Thermo）， 荧光显微镜（带数码相机）、倒置显微镜（德国Leica）， 酶标仪（美国Bio?Rad）等。
2 方法
2.1 原代大鼠神经元的分离与培养［4］
预先用多聚赖氨酸包被培养皿6 h以上，吸出多聚赖氨酸，风干2 h，备用。取SD大鼠乳鼠（出生1～3 d），体积分数为75%的酒精消毒，断头开颅，去脑膜，取大脑皮层神经元，放进Kreb’s解剖液（保持低温），剪碎至大约0.5 mm2，成沙泥状，用Kreb’s解剖液冲洗2～3次，0.25％的胰酶消化10 min，重复消化2～3次，将每次的消化液放入带血清的DMEM中终止消化，将细胞悬液适量吹打70～100次以分散细胞，过筛（180目），1 500 r/min离心5～8 min，去上清，再加入DMEM培养液重悬细胞，细胞计数并调整细胞数使其到2.0～2.5×105个/mL, 将其接种到预先涂以多聚赖氨酸的培养皿中。在37 ℃、5%CO2条件下培养， 培养1 d，细胞贴壁后，换液去除死细胞。在48 h后，加入胶质细胞抑制阿糖胞苷，每3天换液1次，培养1个星期，可做实验。
2.2 体外细胞缺氧模型的制备［5］
用培养了1个星期的细胞置密闭容器中，真空泵抽空，继续保持抽取30 min至抽完培养基中溶解氧，然后缓慢充入95％N2及5％CO2恢复到正常气压（在密闭容器中放一气囊指示装置），置37 ℃培养箱培养1、2、4、8、12、24 h。用Hoechst 33258［6］ 、LDH和SRB［7］判断细胞凋亡情况。
2.3 用Hoechst 33258染色检测神经元凋亡（核凋亡小体检测）
粤公网安备 44010602004428号
